lincNMR，癌細(xì)胞增殖與衰老命運(yùn)的譜寫者

    長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度不超過200nt的RNA分子，通常認(rèn)為不編碼蛋白質(zhì)，而是以RNA的形式在多種層面上（表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等）參與蛋白質(zhì)編碼基因調(diào)控。近些年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可以作為致癌或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有望成為新型腫瘤標(biāo)志物和腫瘤治療的靶點(diǎn)。最近，德國癌癥研究中心的Sven Diederichs教授及其團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)LincNMR通過YBX1-RRM2調(diào)控軸影響肝癌細(xì)胞活力、增殖、衰老以及體內(nèi)腫瘤的形成和生長，相關(guān)研究結(jié)果以“The lncRNA lincNMR regulates nucleotide metabolism via a YBX1-RRM2 axis in cancer”為題發(fā)表在Nature Communications雜志上，雜志影響因子為12.121。

研究思路：

結(jié)果：
1.lincNMR在肝細(xì)胞癌中的作用
    作者通過TCGA數(shù)據(jù)庫篩選了9個(gè)lncRNA，并在肝細(xì)胞癌中利用siPOOLs進(jìn)行基于RNAi的表型分析，通過測定肝細(xì)胞癌中ATP含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本RP6-65G23.3產(chǎn)生了最強(qiáng)的細(xì)胞活力下降，可與PLK134或HULC35敲低的效果相比較，命名為lncRNA lincNMR（a）。BrdU檢測發(fā)現(xiàn)lincNMR沉默導(dǎo)致四個(gè)肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖減少30%-80%（b），而lincNMR過表達(dá)挽救了因其沉默而導(dǎo)致的增殖減少（c）。此外，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，lincNMR沉默后多個(gè)細(xì)胞系中處于細(xì)胞周期G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量增加（d）。SA-β-GAL實(shí)驗(yàn)中，β-GAL陽性藍(lán)色細(xì)胞在lincNMR缺失的細(xì)胞系的增多表明其沉默誘導(dǎo)細(xì)胞衰老（e，f）。以上研究結(jié)果說明lincNMR在肝癌細(xì)胞增殖過程中有重要作用。

2.lincNMR表達(dá)特征和在腫瘤生長中的作用
    進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)多種類型的腫瘤組織和正常組織中l(wèi)incNMR表達(dá)具有顯著性差異（a）。通過建立雞絨毛膜尿囊膜異種移植模型發(fā)現(xiàn)lincNMR沉默模型腫瘤尺寸和重量明顯小于對照組(b-d)。

3.lincNMR與YBX1的調(diào)控關(guān)系
    通過RAP和蛋白質(zhì)譜分析，48個(gè)蛋白質(zhì)被顯著富集，22個(gè)候選蛋白質(zhì)與肝癌病人的總生存顯著相關(guān)（a,b），其中，YBX1與生存率有很強(qiáng)的相關(guān)性。利用RBPmap43軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)lincNMR轉(zhuǎn)錄本有3個(gè)YBX1和兩個(gè)SRSF3結(jié)合位點(diǎn)，且YBX1三個(gè)預(yù)測結(jié)果的第一個(gè)位點(diǎn)突變消除野生型lincNMR增殖挽救實(shí)驗(yàn)的效果（c），UV–RIP、RT-qPCR等實(shí)驗(yàn)證實(shí)lincNMR與YBX1蛋白的聯(lián)系（d），YBX1沉默細(xì)胞增殖受損50%（e）。利用熒光素酶檢測肝癌細(xì)胞株lincNNMR沉默后的YBX1活性，發(fā)現(xiàn)YBX1活性顯著降低（f），而YBX1過表達(dá)挽救了部分因lincNMR沉默導(dǎo)致的增殖損傷（g）。以上數(shù)據(jù)說明lincNMR與YBX1相互作用并調(diào)節(jié)YBX1，且YBX1模擬了lincNMR對細(xì)胞增殖的影響，而YBX1對lincNMR的調(diào)控產(chǎn)生了一個(gè)前饋回路作用。

4.lincNMR與YBX1的靶基因
    lincNMR沉默后，RRM2、TK1、TYMS和其他的一些核苷酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶等蛋白表達(dá)強(qiáng)下調(diào)（a,b），且WB和SILAC-MS證實(shí)了RRM2、TK1和TYMS蛋白表達(dá)的降低（c,d），而YBX1缺失也誘導(dǎo)了RRM2、TK1和TYMS蛋白表達(dá)的顯著性降低（e,f）。

    通過siPOOLs實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RRM2、TK1和TYMS的缺失顯著損害了細(xì)胞的增殖，模擬了lincNMR缺失后觀察到的表型（a），而RRM2抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)程在G1期停止（lincNMR沉默效果類似）（b）。此外，YBX1、TK1或TYMS沉默顯著誘導(dǎo)了細(xì)胞衰老（c,d）,并顯著抑制了肝癌細(xì)胞的克隆生成能力，而RRM2缺失后，未留下任何阻止衰老或克隆生成的細(xì)胞（e,f）。以上結(jié)果說明lincNMR、YBX1、RRM2、TK1 和TYMS之間存在相互作用。

5.lincNMR/YBX1/RRM2/TK1/TYMS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
    TCGA數(shù)據(jù)庫肝癌樣本分析顯示YBX1 mRNA的表達(dá)與RRM2、TK1和TYMS mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)（a-c），Chip顯示YBX1蛋白與RRM2、TK1和TYMS基因的啟動(dòng)子區(qū)域相互作用（d），且熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測到RRM2、TK1和TYMS基因的啟動(dòng)子區(qū)域融合到熒光素酶，而lincNMR或YBX1沉默顯著降低了三個(gè)啟動(dòng)子的熒光素酶活動(dòng)（e）。以上結(jié)果進(jìn)一步證明了lincNMR、YBX1、RRM2、TK1和TYMS的調(diào)控作用。

6.lincNMR缺失誘導(dǎo)dNTP水平降低
    由于lincNMR缺失導(dǎo)致dNTP合成酶下調(diào)，進(jìn)一步研究了dNTPs水平是否會(huì)受到影響。通過siPOOLs沉默lincNMR發(fā)現(xiàn)dATP、dCTP、dGTP和dTTP顯著性下調(diào)（a,b），而YBX1沉默也導(dǎo)致了四種dNTPs水平降低（c,d）。通過對lincNMR沉默的細(xì)胞提供額外的dNTPs挽救了lincNMR對細(xì)胞增殖的影響（e,f）。以上結(jié)果說明核苷酸代謝在lincNMR促增殖功能中的重要作用。

7.lincNMR調(diào)控機(jī)制圖

結(jié)論：
    綜上所述，作者確定了腫瘤促進(jìn)lincRNA - lincNMR，并揭示了lincNMR/YBX1-RRM2/TK1/TYMS軸調(diào)控核苷酸代謝和調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖與衰老命運(yùn)的機(jī)制。
參考文獻(xiàn)：
Minakshi Gandhi, Matthias Gro?, Jessica M. Holler, et al. The lncRNA lincNMR regulates nucleotide metabolism via a YBX1 - RRM2 axis in cancer. Nature Communications. 2020.