一箭雙雕的CircITCH：抑制癌癥 減輕阿霉素的心臟毒性

    阿霉素(DOX)是目前最有效的抗腫瘤藥物之一，但是因?yàn)樗袊?yán)重心臟毒性風(fēng)險(xiǎn)，所以其臨床應(yīng)用受到限制。前人的研究已經(jīng)確定CircITCH是一種廣譜的腫瘤抑制環(huán)狀RNA，其宿主基因ITCH參與了doxbicin誘導(dǎo)的心臟毒性(DOXIC)。CircITCH是否在DOXIC中起作用還不清楚。本文為解決這一問題提供了部分答案，并于2020年5月11日發(fā)表于《Circulation Research》IF：14.467期刊上。
技術(shù)路線如下：

本文結(jié)果如下：
1、CircRNA在人類DOXIC處理和健康心臟組織中的表達(dá)模式
    為了篩選潛在的候選circRNA，對(duì)3例DOX誘導(dǎo)的心肌病人組織和3里非疾病健康捐贈(zèng)者的心臟組織進(jìn)行circRNA表達(dá)譜測(cè)序。如圖1A所示，獲得了19112個(gè)circRNAs，其中84.93來自與外顯子基因組。另外，在兩組間差異表達(dá)的circRNA有356個(gè)，207個(gè)在病人中上調(diào)，149個(gè)下調(diào)（Fig. 1B）。對(duì)最顯著上調(diào)的差異circRNA進(jìn)行PCR數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001141，其宿主基因ITCH下調(diào)并參與DOXIC，因此，作者初步選定ITCH來源的circRNA。
    對(duì)5個(gè)ITCH來源的circRNAs亞型的驗(yàn)證表明hsa_circ_0001141是僅有的一個(gè)富集趨勢(shì)符合預(yù)期的亞型，將其命名為CircITCH。隨后驗(yàn)證了其首尾相接的環(huán)形結(jié)構(gòu)和大?。‵ig. 1C-F）。亞細(xì)胞定位顯示CircITCH主要分布于細(xì)胞質(zhì)，暗示可能吸附miRNA發(fā)揮作用。隨后，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DOX處理后CircITCH的表達(dá)顯著下降（Fig. 1I-K）。這些數(shù)據(jù)暗示CircITCH在DOXIC中發(fā)揮作用。

圖1 CircITCH表達(dá)模式在DOXIC在人類樣本

2、CircITCH過表達(dá)減輕了DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，收縮功能障礙和鈣處理缺陷
    隨后作者探究了CircITCH在DOX誘導(dǎo)的hiPSC-CMs損傷和功能異常中的作用。為此，使用三種正常的iPSC細(xì)胞系和五批基于單分子層的心肌分化方案來生成hiPSC-CM。在hiPSC-CM分化后的30-35天使用CircITCH表達(dá)的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)至葡萄糖饑餓純化的hiPSC-CM中，并檢測(cè)到CircITCH的高表達(dá)，而ITCH的表達(dá)無變化。同時(shí)使用CircITCH-ir沒有下游反向序列做對(duì)照。將上述構(gòu)建的細(xì)胞暴露于DOX，檢測(cè)到CircITCH在hiPSC-CMs中過表達(dá)可以防止細(xì)胞活性喪失(Fig. 2A-D)。CircITCH過表達(dá)也能抑制乳酸脫氫酶(LDH)滲漏、心肌細(xì)胞壞死指數(shù)和EthD1陽(yáng)性死亡細(xì)胞數(shù)(Fig. 2B, E-F)。
    DOX處理后在hiPSC-CMs細(xì)胞中觀察到單層的收縮/松弛速度和變形距離顯著下降，而CircITCH過表達(dá)能顯著阻止上述趨勢(shì)，并且DOX處理的hiPSC-CMs細(xì)胞的收縮特性都得到明顯改善(Fig. 2G-I)。此外，作者在單細(xì)胞水平進(jìn)行了鈣離子成像檢測(cè)，與上述結(jié)果一致，DOX可降低hiPSC-CMs的鈣波幅并引起舒張期鈣超載，相反的，CircITCH過表達(dá)緩和上述改變(Fig. 2J-L)。這些結(jié)果證明CircITCH過表達(dá)保護(hù)免受DOX誘導(dǎo)的hiPSC-CMs細(xì)胞損傷和功能異常。

圖2 CircITCH減輕了DOXIC在hiPSC-CMs的作用和改善其功能

3、CircITCH過表達(dá)可緩解DOX對(duì)hiPSC-CMs細(xì)胞/線粒體的氧化應(yīng)激和DNA損傷
    為了探究CircITCH引起的心肌保護(hù)機(jī)制，接下來評(píng)估hiPSC-CMs細(xì)胞的氧化應(yīng)激和DNA損傷水平，這是DOXIC相關(guān)的兩個(gè)主要的指標(biāo)。與此前的報(bào)道一致，DOX處理引發(fā)DNA雙鏈斷裂（DSB），導(dǎo)致γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞的比例增加(Fig. 3A, C, D)，該結(jié)果可通過ATM磷酸化增加證實(shí)(Fig. 3 B, E, F)。另一個(gè)DNA損傷的指標(biāo)，8-OHdG泄露，其結(jié)果與上述一致(Fig. 3J)。此外，CircITCH過表達(dá)可以減緩線粒體DNA損傷(Fig. 3I)。類似的，DOX處理增加了線粒體和細(xì)胞的氧化應(yīng)激，但CircITCH過表達(dá)可以部分消除這種反應(yīng)(Fig. 3 G, H, K)。

圖3 CircITCH可緩解DOX對(duì)hiPSC-CMs細(xì)胞/線粒體的氧化應(yīng)激和DNA損傷

4、CircITCH保護(hù)免受DOXIC通過miR-330-5p
    通過對(duì)RegRNA 2.0和CircInteractome的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行重疊獲得了8個(gè)CircITCH潛在的靶向miRNA (Fig. 4A)。生物素標(biāo)記的CircITCH探針pull-down實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)到miR-330-5p, miR-214-3p, miR-7-5p, 和miR-1296的顯著富集(Fig. 4B-E)。熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-330-5p最能顯著改變熒光素酶活性。此外，生物素偶聯(lián)miR-330-5p比生物素偶聯(lián)突變體探針捕獲更多CircITCH (Fig. 4 F, G)，F(xiàn)ISH顯示CircITCH和miR330-5p存在共定位(Fig. 4H)。這些結(jié)果驗(yàn)證了miR330-5p可以在hiPSC-CMs中與CircITCH結(jié)合。

圖4 CircITCH在hiPSC-CMs中起著內(nèi)源性miR-330-5p海綿的作用

5、MiR-330-5p在dox處理的hiPSC-CMs中上調(diào)，其沉默可防止DOXIC
    如圖Fig. 5A所示，DOX處理后miR-330-5p的表達(dá)顯著上調(diào)。因此，隨后進(jìn)行了miR-330-5p的抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，抑制miR-330-5p后細(xì)胞活力增強(qiáng)，細(xì)胞死亡減少，LDH泄露降低，改善hiPSC-CMs的收縮和舒張速度，提高鈣波幅，降低舒張期鈣超載，減弱細(xì)胞和線粒體DNA損傷，抑制細(xì)胞和線粒體氧化應(yīng)激，其效果與CircITCH過表達(dá)一致(Fig. 5B-M)。這些結(jié)果表明抑制miR-330-5p可以顯著抑制hiPSC-CMs中的DOXIC。

圖5 MiR-330-5p在dox處理的hiPSC-CMs中上調(diào)，其沉默可防止DOXIC

6、在DOX暴露的hiPSC-CMs細(xì)胞中，SIRT6、BIRC5和ATP2A2直接靶向miR-330-5p，并受到CircITCH/miR-330- 5p軸調(diào)控
    如圖6A所示，GSE數(shù)據(jù)庫(kù)GSE79413, GSE64476, 和GSE97642這三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)重疊的組合識(shí)別出84個(gè)miR-330- 5p的候選靶標(biāo)。隨后通過PCR芯片，鑒定miR-330- 5p下調(diào)靶基因和DOX處理下調(diào)靶基因的重合基因，得到三個(gè)候選目標(biāo)分子SIRT6、BIRC5和ATP2A2，隨后進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-330- 5p可以有效降低上述三個(gè)報(bào)告載體的熒光活性，而結(jié)合位點(diǎn)突變后熒光素酶活性沒有顯著改變，證明三個(gè)分子與miR-330- 5p具有結(jié)合作用(Fig. 6C-E)。

圖6 在DOX處理的hiPSC-CMs中，miR-330-5p直接作用于SIRT6、BIRC5和ATP2A2

7、CircITCH改善小鼠DOXIC
    為了在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證CircITCH是否參與DOXIC調(diào)節(jié)，使用AAV9載體系統(tǒng)在小鼠中過表達(dá)CircITCH。過表達(dá)效率如圖7B所示。在急性小鼠模型中，HE染色觀察到CircITCH的過表達(dá)減少了DOX誘導(dǎo)的心室組織廣泛空泡化(Fig. 7C, D)。提示心肌損傷的心肌酶研究顯示，CircITCH過表達(dá)有效地降低了DOX誘導(dǎo)的血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、LDH和肌酸激酶(肌/腦)水平(Fig. 7E-G)。此外，功能性心肌研究顯示，包括超聲心動(dòng)圖和侵入性血流動(dòng)力學(xué)方法，證明CircITCH過表達(dá)顯著提高了由阿霉素誘導(dǎo)降低的左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室部分縮短(LVFS)，左心室收縮末期和舒張末期壓力(LVESP)和一階導(dǎo)數(shù)的LV壓力，但過表達(dá)降低了DOX引起的左心室舒張末期壓力(LVEDP)的升高(Fig. 7H-O)。這些結(jié)果表明CircITCH在小鼠體內(nèi)同樣具有保護(hù)免受DOXIC傷害的作用。

圖7 AAV9介導(dǎo)的CircITCH過表達(dá)可改善小鼠DOXIC

    總之，如圖8所示，CircITCH發(fā)揮其潛在功能，作為ceRNA來吸附miR-330-5p，從而激活miR-330-5p靶標(biāo)SIRT6，BIRC5（Survivin）和ATP2A2（SERCA2a），從而通過改善DOXIC通過減少氧化壓力和DNA損傷，細(xì)胞死亡，收縮功能障礙和鈣處理缺陷。
    此外，CircITCH被證實(shí)是各種實(shí)體瘤中的抑癌劑（右上）。 因此，本文揭示了CircITCH在DOXIC進(jìn)展中的新作用，并將其確定為促進(jìn)基于阿霉素的化學(xué)療法的有希望的治療劑。 因此，CircITCH具有一箭雙雕的作用，即增強(qiáng)腫瘤抑制作用，同時(shí)降低化學(xué)療法的心臟毒性。

圖8 假設(shè)示意圖

參考文獻(xiàn)：

Han Dong., Wang Yongjun., Zhang Jibin., Dai Xinchun., Zhou Tingwen., Chen Jiangwei., Tao Bo., Wang Yabin., Cao Feng.(2020). The Tumor-Suppressive Human Circular RNA CircITCH Sponges miR-330-5p to Ameliorate Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity Through Upregulating SIRT6, Survivin, and SERCA2a. Circ. Res., undefined(undefined), undefined. doi:10.1161/CIRCRESAHA.119.316061