LINC00941促進大腸癌轉移

    LINC00941是一種新的lncRNA，在腫瘤發(fā)生過程中表現(xiàn)出原發(fā)性和促轉移行為。然而，其在轉移性大腸癌中的作用仍不清楚。因此，小編給大家介紹發(fā)表于影響因子為10.717的“Cell Death & Differentiation”的文章“LINC00941 promotes CRC metastasis through preventing SMAD4 protein degradation and activating the TGF-β/SMAD2/3 signaling pathway”，旨在探討LINC00941在大腸癌轉移中的作用及其機制。

    在本文中，大腸癌中LINC00941表達上調，且上調LINC00941與預后不良有關。在功能上，LINC00941促進裸鼠的遷移和侵襲能力，加速肺轉移。在機制上，LINC00941激活了大腸癌細胞中的EMT。LINC00941通過直接結合SMAD4蛋白MH2結構域并與β-TrCP競爭以阻止SMAD4蛋白降解激活TGF-β/SMAD2/3信號通路，從而激活EMT。
技術路線：

結果：
1.LINC00941表達上調與大腸癌預后不良有關
    組織微陣列證實LINC00941在大腸癌組織中的擴增表達，LINC00941主要定位于細胞質（圖1a），在大腸癌組織中表達上調（圖1b）。Kaplan-Meier生存率和Cox比例風險分析表明，與低LINC00941表達水平的CRC患者相比，具有較高LINC00941表達水平的CRC患者的總生存時間（OS）顯著縮短，表明較高的LINC00941水平是結直腸癌患者預后不良的獨立危險因素（圖1c）。利用TCGA，我們發(fā)現(xiàn)LINC00941是一種轉移和生存相關的lncRNA，與癌旁非腫瘤組織相比（圖1d）在大腸癌組織中上調，并且與大腸癌患者的OS時間相關（圖1e）。ISH染色進一步證實，LINC00941在腫瘤組織中的表達顯著增高，在淋巴結轉移灶中表達最高（圖1f，g）。我們還比較了LINC00941在大腸癌細胞系（HT-29、HCT-116、SW480、SW620和LoVo細胞）和永生化正常結腸上皮細胞（FHC細胞）中的表達，發(fā)現(xiàn)LINC00941在所有研究的大腸癌細胞系中高表達，尤其是在高侵襲性大腸癌細胞系（SW620和LoVo）中與FHC細胞相比過表達，提示LINC00941在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著致癌作用（圖1h）。

2.LINC00941促進大腸癌細胞的遷移和侵襲能力，并激活EMT
    為了闡明LINC00941在大腸癌中的生物學意義，我們分別用攜帶LINC00941 cDNA或sh-LINC00941的慢病毒載體在HCT-116和LoVo細胞中過表達或沉默LINC00941。與對照組相比，HCT-116細胞中LINC00941的過表達顯著增加了細胞的侵襲和遷移能力，而LoVo細胞中LINC00941的下調對細胞的侵襲和遷移能力有相反的影響（圖2a，b）。用sh-LINC00941轉染的LoVo細胞處理的裸鼠產(chǎn)生的肺轉移結節(jié)較少，而用LINC00941過表達的HCT-116細胞處理的裸鼠比相應的對照組產(chǎn)生更多的肺轉移結節(jié)（圖2c，d）。此外，與對照組相比，接受HCT-116-LINC00941細胞的裸鼠的OS較短，而接受LoVo-ShLINC00941細胞的裸鼠OS更長（圖2e）。這些數(shù)據(jù)表明LINC00941對CRC進展有促進作用。此外，LoVo Sh-LINC00941細胞表達下調，呈現(xiàn)出更多的上皮形態(tài)，而HCT-116-LINC00941細胞與相應對照組相比呈現(xiàn)出更多的成纖維細胞樣形態(tài)（圖2f，g），這表明LINC00941可能通過激活EMT促進結直腸癌轉移。HCT-116-LINC00941顯示ZO-1和E-cadherin的mRNA和蛋白質水平降低，但波形蛋白、纖維連接蛋白和Twist1的mRNA和蛋白質水平增加（圖2h，i）。相反，LoVo Sh-LINC00941細胞顯示ZO-1和Ecadherin的mRNA和蛋白質水平增加，但波形蛋白、纖維連接蛋白和Twist1的mRNA和蛋白質水平降低（圖2h，i），進一步證實LINC00941至少部分通過調節(jié)EMT促進結直腸癌細胞的侵襲和遷移。

3.LINC00941通過抑制SMAD4泛素化增強其穩(wěn)定性
    LncRNAs通常通過RNA-蛋白相互作用影響基因表達。因此，我們進一步研究了可能與LINC00941相互作用的蛋白，以獲得關于LINC00941誘導的EMT在CRC轉移中的深入機制觀點。RNA下拉分析表明SMAD4可以特異性結合LINC00941（圖3a）。同時，SMAD4在LoVo Sh-LINC00941細胞中表達下調，在HCT-116-LINC00941細胞中上調（圖3b）。一致地，SMAD4富集于生物素標記的LINC00941組中（圖3c）。此外，通過瓊脂糖凝膠電泳和RIP分析進一步驗證了LINC00941和SMAD4之間的相互作用（圖3d，e）。為了確定LINC00941和SMAD4的確切結合區(qū)域，我們構造了一系列截斷的LINC00941和SMAD4結構。LINC00941的1465到1895核苷酸可以結合SMAD4，而SMAD4的MH2結構域和全長SMAD4可以結合LINC00941（圖3f，g），表明LINC00941是SMAD4的結合伙伴。細胞質lncRNAs通常負責蛋白質修飾的轉錄后調節(jié)。LINC00941抑制導致SMAD4蛋白表達減少，而LINC00941過表達上調SMAD4（圖3b）。此外，如LINC00941通過延長其降解半衰期來增強SMAD4蛋白的穩(wěn)定性（圖3h，i），這意味著LINC00941可以通過其蛋白質降解來調節(jié)SMAD4。由于SMAD4蛋白降解是通過泛素-蛋白酶體途徑介導的，為了深入了解LINC00941誘導SMAD4降解的機制，我們用蛋白酶體抑制劑（MG132）處理LoVo-Sh-LINC00941細胞。通過Western blot分析確定，MG132顯著恢復了LoVo-Sh-LINC00941細胞中的SMAD4蛋白水平（圖3j），表明泛素蛋白酶體途徑參與了LINC00941誘導的SMAD4降解。為了進一步驗證這一發(fā)現(xiàn)，我們評估了LINC00941過表達和LINC00941沉默的CRC細胞中SMAD4的多泛素化。如預期，當LINC00941過表達時，SMAD4泛素化顯著降低，而當LINC00941被沉默時，SMAD4泛素化顯著增加（圖3k，l）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明LINC00941可以通過抑制SMAD4在CRC中的泛素化而穩(wěn)定SMAD4。

4.LINC00941通過與β-TrCP競爭抑制SMAD4泛素化
    鑒于SMAD4可被β-TrCP多泛素化和降解，我們評估了β-TrCP在大腸癌SMAD4泛素化和降解中的功能意義。在LoVo和HCT-116細胞中抑制β-TrCP的表達可以顯著提高SMAD4蛋白的表達水平（圖4a）。同樣，在抑制了LoVo和HCT-116細胞中β-TrCP的表達后，通過免疫沉淀發(fā)現(xiàn)SMAD4蛋白泛素化水平顯著降低（圖4b）。接下來，我們發(fā)現(xiàn)缺少LINC00941顯著增加了SMAD4和β-TrCP的結合（圖4c）。相反，過表達LINC00941可以顯著提高抑制SMAD4和β-TrCP的結合（圖4d）。此外，我們進一步確定SMAD4和FL-SMAD4的MH2結構域可以結合β-TrCP（圖4e），表明β-TrCP通過結合SMAD4和FL-SMAD4的MH2結構域來控制SMAD4的泛素化和降解。考慮到SMAD4和FL-SMAD4的MH2結構域可以結合LINC00941，我們假設LINC00941通過與β-TrCP競爭來抑制SMAD4泛素化。正如預期的那樣，競爭性RNA下拉分析進一步證實了LINC00941和β-TrCP之間的競爭（圖4e）?？傊@些數(shù)據(jù)證實了LINC00941可以通過與β-TrCP競爭來提高SMAD4蛋白的穩(wěn)定性，從而防止SMAD4降解。

5.在轉移性大腸癌中，TGF-β1上調LINC00941，并與SMAD2/3信號通路的激活有關
    TGF-β1/SMAD信號通路是EMT的一個關鍵調節(jié)因子，SMAD4是一個重要的輔因子。鑒于LINC00941對SMAD4的穩(wěn)定性很重要，并且LINC00941包含預測的TGF-β1靶點，我們評估了LINC00941在TGF-β1/SMAD信號通路中的作用。結果表明，當用TGF-β1處理LINC00941沉默的細胞時，LINC00941水平顯著升高，而當LINC00941過表達的細胞受到TGF-β1抑制劑disitertide的作用時，內源性LINC00941水平顯著降低（圖5a，b）。一致地，與對照組相比，TGF-β1處理增加了LINC00941沉默的細胞的侵襲和遷移能力，而TGF-β1受體的抑制減輕了LINC00941過表達細胞的侵襲和遷移能力（圖5c，d）。此外，與對照組相比，用disitertide處理過表達的LINC00941細胞顯示ZO-1和Ecadherin的mRNA和蛋白質水平增加（圖5e，f）。相比之下，LINC00941沉默的細胞顯示ZO-1和E-cadherin的mRNA和蛋白質水平降低，但波形蛋白、纖維連接蛋白和Twist1的mRNA和蛋白質水平增加（圖5e，f），進一步證實TGF-β1參與了LINC00941誘導的EMT。更重要的是，熒光素酶報告分析顯示，熒光素酶活性在使用TGF-β1處理后顯著增加（圖5g）。用LoVo Sh-LINC00941細胞和TGF-β處理的裸鼠產(chǎn)生更多的肺轉移結節(jié)，而HCT-116-LINC00941細胞和disitertide處理的裸鼠比相應的對照組產(chǎn)生更少的肺轉移結節(jié)（圖5h，i）。此外，與對照組相比，用LoVo Sh-LINC00941細胞和TGF-β處理的裸鼠的OS較短，HCT-116-LINC00941細胞和disitertide處理的裸鼠的OS較對照組長（圖5j）。這些數(shù)據(jù)證實了TGF-β1與LINC00941有很強的相互作用。

結論：
    我們的研究證實，LINC00941通過阻止SMAD4蛋白降解激活TGF-β/SMAD2/3信號通路促進大腸癌的轉移，為進一步研究轉移性大腸癌的機制和新的潛在治療靶點提供了新的視角。