核miRNA抑制TFEB介導(dǎo)的自噬
溶酶體是至關(guān)重要的細(xì)胞器，負(fù)責(zé)降解蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。轉(zhuǎn)錄因子EB（TFEB）是調(diào)節(jié)溶酶體生物發(fā)生和自噬的主要轉(zhuǎn)錄因子。TFEB在細(xì)胞核中的功能是精細(xì)調(diào)節(jié)的，MiRNA是否參與TFEB的精密調(diào)節(jié)功能，今日揭曉答案。
技術(shù)路線:
結(jié)果:
1. 篩選與CLEAR結(jié)合的候選miRNA
為調(diào)查核miRNA是否調(diào)節(jié)TFEB依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，將來自HEK293細(xì)胞的核RNA與含有TFEB的結(jié)合基序-CLEAR元素的DNA片段共孵育，通過下拉測定，TFEB與CLEAR元素結(jié)合。RNA測序檢測下拉的核miRNA，并結(jié)合熒光素酶報(bào)告基因鑒定出miR-30b-5p使CLEAR熒光素酶報(bào)告基因活性減少46％，在溶酶體生物發(fā)生基因的啟動子上觀察到與miR-30b-5p互補(bǔ)的基序。通過FRET分析驗(yàn)證miR-30b-5p和CTSD基因的DNA啟動子片段之間的直接互動。總而言之，新型miRNA miR-30b-5p可以與CLEAR結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄激活。
2. MiR-30b-5p抑制含有CLEAR元素基因的反式激活
FISH檢測顯示miR-30b-5p位于細(xì)胞質(zhì)和核。在miR-30b-5p敲除HEK293細(xì)胞中，TFEB在CLCN7，MCOLN1，CTSD和GLA 4個基因啟動子片段上的富集增加，含有CLEAR元素的基因（例如CTSA，CTSD，MCOLN1和LAMP2）的活性在miR-30b-5p轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中減少，含有CLEAR元素的基因的mRNA水平在轉(zhuǎn)染miR-30b-5p細(xì)胞中顯著降低。si-Importin8介導(dǎo)成熟miRNA的細(xì)胞質(zhì)至細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致核miR-30b-5p水平降低88％和miR-30b-5p對上述基因mRNA表達(dá)的抑制作用消失。這些結(jié)果證實(shí)miR-30b-5p抑制了細(xì)胞核中含CLEAR元件基因的轉(zhuǎn)錄激活。
3. 過表達(dá)miR-30b-5p抑制溶酶體生物發(fā)生與自噬
TFEB是調(diào)節(jié)溶酶體生物發(fā)生和自噬的主要轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)染miR-30b-5p的HEK293細(xì)胞中溶酶體發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)被抑制，miR-30b-5p能減少營養(yǎng)剝奪或Torin1處理的溶酶體基因蛋白質(zhì)水平的增加。miR-30b-5p降低了經(jīng)典的溶酶體標(biāo)記基因LAMP1和Lysotracker的熒光強(qiáng)度。這些結(jié)果表明過表達(dá)miR-30b-5p抑制了溶酶體的生物發(fā)生。溶酶體生物發(fā)生是自噬溶酶體途徑中不可缺少的一個過程，TFEB也調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的表達(dá)。與巴氟霉素A1共處理，miR-30b-5p轉(zhuǎn)染的細(xì)胞LC3-II水平降低，miR-30b-5p可抑制自噬體和溶酶體的融合。以上表明miR-30b-5p抑制了自噬體的生物發(fā)生，以及自噬體-溶酶體融合。
4. 敲除內(nèi)源性miR-30b-5p升高溶酶體生物發(fā)生和自噬
溶酶體生物發(fā)生和自噬基因的蛋白質(zhì)水平在miR-30b-5p基因敲除HEK293中上調(diào)，與EBSS或Bafilomycin A1共使用時，上述基因的增加更為顯著。LAMP1和Lysotracker以及串聯(lián)EGFP-mCherry-LC3探針證實(shí)了內(nèi)源性miR-30b-5p和自噬溶酶體過程之間的關(guān)系。
5. miR-30b-5p對溶酶體過程和自噬的抑制作用依賴TFEB
Mut-miR-30b-5p（CLEAR的潛在結(jié)合位點(diǎn)被突變）逆轉(zhuǎn)了miR-30b-5p對TFEB轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用。此外，溶酶體和自噬相關(guān)基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平不受Mut-miR-30b-5p影響。miR-30b-5p過表達(dá)細(xì)胞中，抑制TFEB挽救了溶酶體和自噬相關(guān)基因的螢光素酶活性和mRNA水平的降低，TFEB的過表達(dá)可以部分挽救miR-30b-5p的上述抑制作用。這些數(shù)據(jù)表明，TFEB對miR-30b-5p介導(dǎo)的溶酶體生物和自噬的抑制是必不可少的。
6. miR-30b-5p對小鼠肝臟自噬溶酶體過程的調(diào)控
進(jìn)一步探索miR-30b-5p在體內(nèi)的功能，通過尾靜脈將重組腺病毒注射到小鼠中，禁食48小時以誘導(dǎo)小鼠肝臟中溶酶體生物發(fā)生和自噬，在肝臟中證實(shí)過表達(dá)成熟的miR-30b-5p，導(dǎo)致TFEB和溶酶體生物發(fā)生基因的啟動子pol II的富集減少，LAMP1和LC3-II蛋白降低，SQSTM1 / p62蛋白增加。這些結(jié)果顯示miR-30b-5p抑制了饑餓引起的自噬溶酶體過程。
