lncRNA-ZNF649-AS1誘導(dǎo)曲妥珠單抗耐藥

    lncRNAs在曲妥珠單抗耐藥中的調(diào)控機制至今尚未建立。今天小編為大家?guī)戆l(fā)表于影響因子為8.986的“Molecular Therapy”上的文章“l(fā)ncRNA ZNF649-AS1 Induces Trastuzumab Resistance by Promoting ATG5 Expression and Autophagy”，為大家詳細(xì)介紹lncRNA ZNF649-AS1在曲妥珠單抗耐藥中調(diào)控的機制。

    我們的結(jié)果顯示，與敏感細(xì)胞相比，ZNF649-AS1在曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞中表達(dá)更高。ZNF649-AS1的表達(dá)增加與乳腺癌患者的不良反應(yīng)和較短的生存時間有關(guān)。在曲妥珠單抗處理下，H3K27ac修飾上調(diào)了ZNF649-AS1，敲除ZNF649-AS1通過調(diào)節(jié)ATG5表達(dá)和自噬逆轉(zhuǎn)曲妥珠單抗的耐藥性。機制上，ZNF649-AS1與PTBP1蛋白相關(guān)，進(jìn)一步促進(jìn)了ATG5基因的轉(zhuǎn)錄活性。
技術(shù)路線:

結(jié)果：
1.lncRNA ZNF649-AS1在曲妥珠單抗耐藥乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)
    為了確定與曲妥珠單抗耐藥密切相關(guān)的lncRNAs，我們使用已建立的曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞進(jìn)行HiSeq測序。分散圖和火山圖用于評估抗曲妥珠單抗治療的SKBR-3細(xì)胞（SKBR-3-TR細(xì)胞）和SKBR-3細(xì)胞（圖1A和1B）之間基因表達(dá)的變化。總共有639個lncRNAs被鑒定為顯著差異表達(dá)（圖1C）。為了確定最有前景的lncRNAs，我們將分析重點放在前20個上調(diào)和20個下調(diào)的lncRNAs上，如圖1D中的熱圖所示。我們從上調(diào)最多的組中選擇了三個候選的lncRNAs，從下調(diào)最嚴(yán)重的組中選擇了兩個。我們檢測了30例HER2+患者配對乳腺癌組織和癌旁非腫瘤組織中所選基因的表達(dá)。ZNF649-AS1是上調(diào)幅度最大的lnRNA（圖1E）。此外，與親代細(xì)胞相比，抗曲妥珠單抗治療的SKBR-3-TR細(xì)胞和BT474細(xì)胞（B7474-TR細(xì)胞）中的ZNF649AS1顯著上調(diào)（圖1F）。

2.lncRNA-ZNF649-AS1與曲妥珠單抗治療的不良反應(yīng)相關(guān)
    為了驗證ZNF649-AS1是否與曲妥珠單抗治療相關(guān)，我們檢測了60例接受曲妥珠單抗治療的乳腺癌組織中ZNF649-AS1的表達(dá)。如圖2A所示，與有反應(yīng)的患者相比，無反應(yīng)患者的ZNF649-AS1上調(diào)。接著，90份接受曲妥珠單抗治療的患者的血清樣本被用來檢測ZNF649-AS1的表達(dá)。與有反應(yīng)的患者相比，ZNF649-AS1在無反應(yīng)患者中顯著上調(diào)（圖2B）。此外，ROC曲線顯示ZNF649-AS1表達(dá)具有較高的診斷價值（圖2C）。通過將患者分為高或低ZNF649-AS1表達(dá)組，使用從ROC曲線獲得的分層標(biāo)準(zhǔn)，我們發(fā)現(xiàn)高ZNF649-AS1表達(dá)組對曲妥珠單抗治療反應(yīng)的患者比例遠(yuǎn)低于ZNF649-AS1低表達(dá)組（圖2D）。更重要的是，Kaplan-Meier生存分析表明，高表達(dá)的ZNF649-AS1與整體生存率和無進(jìn)展生存率相關(guān)（圖2E）。

3.曲妥珠單抗通過誘導(dǎo)H3K27乙酰化增加ZNF649-AS1的表達(dá)
    接下來，我們研究了曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞中ZNF649-AS1上調(diào)的潛在機制。通過分析轉(zhuǎn)錄修改區(qū)域，我們發(fā)現(xiàn)在7個細(xì)胞系中，在ZNF649-AS1啟動子區(qū)上游有一個富集的H3K27ac結(jié)合區(qū)（圖3A）。然后我們使用抗H3K27ac抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析，發(fā)現(xiàn)H3K27ac在ZNF649-AS1啟動子區(qū)富集。此外，與親代細(xì)胞相比，SKBR-3-TR和BT474-TR細(xì)胞中H3K27ac的富集水平顯著提高（圖3B）。為了進(jìn)一步證實曲妥珠單抗治療的效果，我們用曲妥珠單抗處理SKBR-3和BT474細(xì)胞48小時。如圖3C和3D所示，與對照細(xì)胞相比，曲妥珠單抗處理細(xì)胞中H3K27ac富集和ZNF649-AS1水平增加。與化療敏感患者相比，曲妥珠單抗耐藥患者乳腺癌組織中H3K27ac富集也增加（圖3E）。然后我們用C646（一種著名的乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑）處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)H3K27ac富集和ZNF649-AS1表達(dá)被顯著抑制（圖3F和3G）。總的來說，我們的結(jié)果表明曲妥珠單抗處理通過誘導(dǎo)啟動子區(qū)域H3K27ac富集來增加ZNF649-AS1的水平。

4.沉默lncRNA-ZNF649-AS1逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞曲妥珠單抗耐藥性
    為了確定ZNF649-AS1在曲妥珠單抗耐藥中的作用，我們使用特異性抑制劑沉默了ZNF649-AS1的表達(dá)。如圖4A所示，我們觀察到轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞中ZNF649-AS1的表達(dá)顯著降低。實時細(xì)胞分析（RTCA）顯示，ZNF649-AS1的敲除顯著抑制曲妥珠單抗治療后的細(xì)胞活性（圖4B）。此后，我們評估了它在細(xì)胞凋亡中的作用。TUNEL試驗結(jié)果顯示，ZNF649-AS1敲除后細(xì)胞凋亡增加（圖4C）。接下來，我們研究了ZNF649-AS1過表達(dá)對SKBR-3和BT474親本細(xì)胞抗曲妥珠單抗抗性的影響。如圖4D所示，轉(zhuǎn)染ZNF649-AS1質(zhì)粒后，ZNF649-AS1在這些細(xì)胞中過表達(dá)。通過使用曲妥珠單抗處理SKBR-3和BT474細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，ZNF649-AS1誘導(dǎo)的對曲妥珠單抗的抗性增強（圖4E）。此外，ZNF649-AS1可抑制SKBR-3和BT474細(xì)胞的凋亡（圖4F）。

5.lncRNA ZNF649-AS1對曲妥珠單抗誘導(dǎo)的自噬是必需的
    通過GO分析，我們假設(shè)自噬可能參與了ZNF649-AS1的功能（圖5A）。為了驗證這一假設(shè)，我們測量了自噬標(biāo)記物的LC3和p62水平。值得注意的是，曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞比相應(yīng)的親代細(xì)胞顯示出更高的LC3-II和更低的p62蛋白水平，這表明當(dāng)發(fā)生化療耐藥時，自噬通量被誘導(dǎo)（圖5B）。曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞顯示出LC3斑點（圖5C）和自噬體（圖5D）的形成增加。為了驗證自噬是否對曲妥珠單抗耐藥至關(guān)重要，我們用氯喹（CQ）處理曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞。結(jié)果表明，CQ處理抑制了自噬，并逆轉(zhuǎn)了化療耐藥狀態(tài)（圖5E和5F）。
    接下來，我們研究了ZNF649-AS1在自噬活性中的作用。ZNF649-AS1基因敲除導(dǎo)致SKBR-3-TR中LC3-II水平降低，p62水平增強。相反，在ZNF649-AS1過表達(dá)的細(xì)胞中，LC3-II水平增加，而p62水平降低（圖5G）。沉默SKBR-3-TR細(xì)胞中的ZNF649-AS1減少了LC3斑點的數(shù)量并阻止了自噬體的形成，而ZNF649-AS1的過表達(dá)導(dǎo)致SKBR-3細(xì)胞中LC3斑點和自噬體的數(shù)量增加（圖5H和5I）。綜上所述，我們的結(jié)果表明曲妥珠單抗耐藥誘導(dǎo)自噬活性增強，而抑制ZNF649-AS1可以逆轉(zhuǎn)自噬，從而誘導(dǎo)化療敏感性。

6.ZNF649-AS1通過上調(diào)ATG5誘導(dǎo)曲妥珠單抗耐藥和自噬
    為了找到導(dǎo)致ZNF649-AS1誘導(dǎo)的自噬和曲妥珠單抗抗性的基因，我們分析了ZNF649-AS1和靶mRNAs的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（圖6A）。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)了一個自噬相關(guān)的mRNA，ATG5，它被ZNF649-AS1靶向。與親代細(xì)胞相比，在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上，SKBR-3-TR和BT474-TR細(xì)胞中ATG5上調(diào)（圖6B）。此外，與對治療有反應(yīng)的患者相比，對曲妥珠單抗耐藥的患者組織中ATG5上調(diào)（圖6C）。根據(jù)從Pan-Cancer Atlas獲得的數(shù)據(jù)，ZNF649-AS1與ATG5表達(dá)略有正相關(guān)（圖6D）。在接受曲妥珠單抗治療的HER2+患者的60個組織中進(jìn)一步證實了這種相關(guān)性（圖6E）。接下來，我們試圖確定ATG5是否對ZNF649AS1調(diào)節(jié)的曲妥珠單抗耐藥性至關(guān)重要。我們發(fā)現(xiàn)ATG5的抑制減弱了曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞的化療耐藥性（圖6F），而增加ATG5則促進(jìn)了親代細(xì)胞對曲妥珠單抗的耐藥性（圖6G）。此外，ATG5的抑制消除了ZNF649-AS1在敏感細(xì)胞中誘導(dǎo)的曲妥珠單抗耐藥性（圖6H），而增強的ATG5消除了ZNF649-AS1敲除誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞的化學(xué)敏感性（圖6I）。

7.ZNF649-AS1通過招募PTBP1激活A(yù)TG5的轉(zhuǎn)錄
    我們用細(xì)胞分離PCR發(fā)現(xiàn)ZNF649-AS1主要分布在乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖7A）。RNA熒光原位雜交（RNA-FISH）證實了這一結(jié)論（圖7B），表明ZNF649-AS1在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)下游通路?；贛FE評估，我們預(yù)測981-1190 nt位點的ZNF649-AS1轉(zhuǎn)錄物形成了莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖7C），這對于與靶向RNA結(jié)合蛋白的關(guān)聯(lián)至關(guān)重要。為了驗證與ZNF649-AS1相關(guān)的蛋白質(zhì)，進(jìn)行了RNA下拉和質(zhì)譜分析。我們發(fā)現(xiàn)了PTBP1，它可能參與定位、翻譯起始和mRNA穩(wěn)定性。通過設(shè)計ZNF649-AS1探針并進(jìn)行RNA下拉分析，我們發(fā)現(xiàn)PTBP1蛋白被ZNF649-AS1富集（圖7D）。此外，RNA免疫沉淀（RIP）試驗證實ZNF649-AS1是由PTBP1抗體沉淀的（圖7E）。這些發(fā)現(xiàn)提示ZNF649-AS1與PTBP1蛋白相關(guān)，發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。
    我們試圖證明ZNF64-AS1通過與PTBP1結(jié)合來提高ATG5的mRNA穩(wěn)定性。圖7F顯示PTBP1的沉默下調(diào)了ATG5的mRNA水平。此外，PTBP1的沉默消除了ZNF649-AS1誘導(dǎo)的ATG5 mRNA的增加（圖7G）。為了確定PTBP1的作用，我們進(jìn)行了RIP分析。ZNF649-AS1的過表達(dá)增加了SKBR-3細(xì)胞中與ATG5結(jié)合的內(nèi)源性PTBP1，而敲除ZNF649-AS1在SKBR-3TR細(xì)胞中產(chǎn)生相反的作用（圖7H）。此外，我們用actinomycin D 處理曲妥珠單抗耐藥細(xì)胞，該actinomycin D廣泛用于阻斷轉(zhuǎn)錄過程，并發(fā)現(xiàn)沉默ZNF649-AS1或PTBP1導(dǎo)致ATG5 mRNA降解增加（圖7I）。此外，ZNF649-AS1的過表達(dá)增加了半衰期，而PTBP1的敲除使半衰期回到正常水平（圖7J）。因此，我們的結(jié)果證明，ZNF649-AS1結(jié)合的PTBP1通過提高mRNA的穩(wěn)定性來增加ATG5的表達(dá)水平。

8.敲除ZNF649-AS1逆轉(zhuǎn)曲妥珠單抗的體內(nèi)自噬作用
    基于我們的體外觀察，我們試圖通過在BALB/c裸鼠模型中建立異種移植來驗證我們的數(shù)據(jù)。通過從裸鼠身上剝離腫瘤，我們在治療20天后為不同組建立異種移植（圖8A）。在sh-ZNF649-AS1組中形成的腫瘤明顯小于sh-NC組（圖8B）。通過進(jìn)行免疫組化（IHC）分析，我們發(fā)現(xiàn)由sh-ZNF649-AS1感染細(xì)胞形成的腫瘤與對照細(xì)胞形成的腫瘤相比，ATG5的表達(dá)水平降低（圖8C）。此外，在sh-ZNF649-AS1組的小鼠中觀察到低水平的LC3斑點（圖8D）和自噬體（圖8E）的形成。

結(jié)論:
    我們發(fā)現(xiàn)ZNF649-AS1直接抑制ATG5的表達(dá)，從而抑制自噬，在乳腺癌抗曲妥珠單抗耐藥中起著關(guān)鍵作用。我們的研究結(jié)果為深入了解ncRNA調(diào)控的腫瘤治療效果提供了依據(jù)，并為開發(fā)更有效的策略來逆轉(zhuǎn)乳腺癌患者曲妥珠單抗耐藥性奠定了基礎(chǔ)。