METL14-胰腺癌發(fā)展的靶點(diǎn)

胰腺癌是人類最致命的癌癥之一。N6甲基腺苷（m6A）是一種常見的真核細(xì)胞mRNA修飾，在生理和病理過(guò)程中起著重要作用。然而，它在胰腺癌中的作用仍不清楚。今天小編為大家介紹一篇影響因子為15.302，發(fā)表于“Molecular Cancer”上的文章“Upregulation of METTL14 mediates the elevation of PERP mRNA N6 adenosine methylation promoting the growth and metastasis of pancreatic cancer”。在本文中，我們發(fā)現(xiàn) METTL14的上調(diào)可以通過(guò)m6A修飾降低PERP水平，促進(jìn)胰腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，因此METTL14是其治療的潛在靶點(diǎn)。

技術(shù)路線：

 結(jié)果：

1）胰腺癌中m6A修飾水平升高

我們測(cè)量了胰腺癌細(xì)胞系和人胰腺癌組織標(biāo)本中m6A的水平。值得注意的是，與人胰腺導(dǎo)管上皮（HPDE）細(xì)胞和正常胰腺組織相比，七種胰腺癌細(xì)胞系中有五種細(xì)胞系的m6A水平升高（圖1a）。類似地，大約70%的胰腺癌組織中m6A水平高于配對(duì)的相鄰組織（圖1b）。此外，還分析了m6A水平與臨床病理學(xué)的關(guān)系。總體生存率低與m6A水平增高顯著相關(guān)（圖1c），且與腫瘤表達(dá)水平低的患者相比，m6A表達(dá)水平較高的腫瘤患者淋巴轉(zhuǎn)移顯著增加（圖1d）。

2）METTL14在胰腺癌中的異常表達(dá)

為了闡明胰腺癌中m6A水平升高的分子機(jī)制，我們?cè)u(píng)估了成對(duì)癌組織和鄰近組織樣本中最重要的m6A調(diào)節(jié)因子（METTL3、METTL14和WTAP）的表達(dá)。值得注意的是，實(shí)時(shí)PCR顯示，與鄰近的健康組織相比，胰腺癌組織中的METTL3、METTL14和WTAP上調(diào)（圖2a）。Western blot顯示，與正常組織相比，胰腺癌組織中METTL3 METTL14和WTAP水平顯著升高。（圖2b）。然而，在復(fù)雜成分中，只有METTL14水平與患者生存率顯著相關(guān)（圖2c）：METTL14水平升高與整體生存率差相關(guān)（圖2c）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明METTL14是一個(gè)主要的m6A調(diào)節(jié)因子，參與胰腺癌的臨床病理學(xué)。

3）METTL14上調(diào)促進(jìn)胰腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

為了評(píng)估METTL14在胰腺癌中的生物學(xué)作用，我們?cè)谌祟愐认侔┘?xì)胞系中過(guò)表達(dá)或敲除METTL14。METTL14的缺失顯著降低了m6A的水平（圖2d）。METTL14基因敲除顯著抑制PANC-1和MIA-PaCa-2細(xì)胞的增殖和集落形成，而METTL14的異位表達(dá)增加了PANC-1和BxPC-3細(xì)胞的增殖和集落形成（圖3a，b）。在裸鼠皮下和原位移植模型中，METTL14表達(dá)的增加促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)。相反，在這些模型中，METTL14的耗竭有效地抑制了腫瘤的生長(zhǎng)（圖3c，d）。這些觀察結(jié)果表明METTL14在體內(nèi)外均能促進(jìn)胰腺癌的生長(zhǎng)。

接下來(lái)，我們研究了METTL14在胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。細(xì)胞遷移分析顯示METTL14的缺失降低了PANC-1和MIA-PaCa-2細(xì)胞的遷移和侵襲性，而過(guò)表達(dá)METTL14對(duì)PANC-1和BXPC-3細(xì)胞的作用則相反（圖3e）。在創(chuàng)傷愈合分析中獲得了類似的遷移數(shù)據(jù)（圖3f）。我們用三種小鼠模型進(jìn)一步研究了體內(nèi)轉(zhuǎn)移。在皮下植入模型中，我們觀察到METTL14缺失或過(guò)表達(dá)分別顯著減少或增加淋巴轉(zhuǎn)移（圖3g）。在原位移植模型中，METTL14的過(guò)表達(dá)顯著加速了胰腺細(xì)胞向肝臟的轉(zhuǎn)移，而METTL14的耗竭減少了肝轉(zhuǎn)移（圖3h）。此外，在小鼠肝轉(zhuǎn)移模型中，METTL14的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致肝轉(zhuǎn)移顯著增加并降低總生存率，而METTL14的耗竭減少了微轉(zhuǎn)移的數(shù)量并延長(zhǎng)了生存期（圖3i）。這些數(shù)據(jù)表明METTL14在胰腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起著重要的促進(jìn)作用。

4）利用RNA-Seq和m6A-Seq識(shí)別METTL14下游靶標(biāo)

為了研究METTL14在胰腺癌中的調(diào)控作用，我們采用RNA-Seq分析PANC-1細(xì)胞、對(duì)照細(xì)胞和METTL14缺失細(xì)胞的基因表達(dá)譜。我們觀察到，在METTL14基因敲除后，564個(gè)基因上調(diào)，715個(gè)基因下調(diào)（圖4a）。 接著，我們使用m6A-Seq來(lái)繪制PANC-1細(xì)胞中具有生理（shCtrl）和降低（shMETTL14）METTL14水平的m6A甲基體。與我們之前的數(shù)據(jù)一致，在對(duì)照和METTL14敲除細(xì)胞中，GGACU基序在m6A位點(diǎn)高度富集（圖4b）。我們鑒定出2225和1124個(gè)m6A修飾轉(zhuǎn)錄本的8238和7820個(gè)m6A峰，其中來(lái)自1564和463轉(zhuǎn)錄本的7496和7078個(gè)峰分別在對(duì)照細(xì)胞和METT L14敲除細(xì)胞中是唯一的（圖4c，d）。為了評(píng)估基因表達(dá)的改變是否是METTL14介導(dǎo)的甲基化（尤其是m6A）的結(jié)果，我們比較了來(lái)自RNA序列和m6A序列的數(shù)據(jù)。RNA序列鑒定出80個(gè)上調(diào)基因和108個(gè)下調(diào)基因顯示m6A修飾，包括前6個(gè)水平升高的基因：EDN1、GNAL、DNAH11、ASS1、PERP、和YIPF6（圖4e）。

5）PERP是胰腺癌重要的METTL14靶基因

為了進(jìn)一步研究METTL14靶基因，我們驗(yàn)證了由RNA Seq和m6A-Seq鑒定的6個(gè)上調(diào)的基因在METTL14缺失的PANC-1細(xì)胞中的表達(dá)。在這些靶點(diǎn)中，PERP mRNA和蛋白質(zhì)水平在METTL14缺失時(shí)增加（圖5a，b）。為了證實(shí)PERP基因經(jīng)過(guò)METTL14介導(dǎo)的m6A修飾，我們進(jìn)行了甲基化RNA免疫沉淀定量PCR（MeRIP-PCR）。這些結(jié)果也表明METTL14可以使PERP基因甲基化（圖5c）。在使用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D處理后，METTL14基因敲除導(dǎo)致PERP轉(zhuǎn)錄半衰期顯著增加（圖5d）。通過(guò)分析我們從shMETTL14細(xì)胞獲得的m6A序列數(shù)據(jù)以及從三個(gè)獨(dú)立的m6A數(shù)據(jù)庫(kù)（SRAMP、RMBase和m6Avar）檢索到的附加信息，我們確定PERP的3’-UTR中的一個(gè)唯一峰是METTL14的潛在靶點(diǎn)。用PERP 3’-UTR報(bào)告熒光素酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，METTL14的敲除大大提高了攜帶野生型PERP 3’-UTR的結(jié)構(gòu)體的熒光素酶活性，而METTL14的過(guò)表達(dá)顯著降低了攜帶野生型PERP 3’-UTR的結(jié)構(gòu)體的熒光素酶活性。（圖5e）。為了進(jìn)一步研究PERP和METTL14表達(dá)之間的關(guān)系，我們?cè)谝认侔┙M織中進(jìn)行了免疫熒光分析，觀察到高表達(dá)METTL14的腫瘤細(xì)胞顯示PERP低表達(dá)，反之亦然（圖5f）。

此外，作為m6A的第一個(gè)特征reader，YT521-B同源域家族（YTH）蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯。為了確定YTHDF2是否是PERP m6A甲基化的潛在讀取器，我們敲除了YTHDF2，并觀察到在胰腺細(xì)胞中PERP表達(dá)顯著增強(qiáng)（圖5g）。YTHDF2基因敲除不僅增加了PERP mRNA的水平和穩(wěn)定性，而且在METTL14過(guò)表達(dá)的情況下也消除了它們的降低（圖5h，i）。這些結(jié)果表明PERP是METTL14的直接靶點(diǎn)，以m6A依賴的方式調(diào)節(jié)METTL14-YTHDF2-PERP軸。

 


6）PERP與METTL14誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲有關(guān)

為了了解PERP在METTL14誘導(dǎo)胰腺癌生長(zhǎng)中的作用，我們?cè)?/span>METTL14缺失的胰腺癌細(xì)胞中敲除PERP。我們發(fā)現(xiàn)PERP的耗竭顯著提高了PANC-1細(xì)胞的活力和集落形成，但也消除了METTL14基因敲除后其下降的趨勢(shì)（圖6a，b）。此外，transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，PERP敲低也顯著抵消了METTL14耗竭依賴對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲能力的抑制（圖6c）。此外，我們構(gòu)建了編碼PERP-WT或PERP的質(zhì)粒，其具有特定的3’-UTR位點(diǎn)突變，并評(píng)估了它們（轉(zhuǎn)染后）對(duì)過(guò)表達(dá)METTL14的胰腺癌細(xì)胞的致瘤特性的影響。我們觀察到METTL14的過(guò)表達(dá)降低了PERP的表達(dá)水平，增加了胰腺癌細(xì)胞的集落形成和侵襲能力（圖。6d-f）。然而，METTL14的過(guò)表達(dá)并不會(huì)影響過(guò)表達(dá)PERP并伴有3’-UTR突變的癌細(xì)胞（圖。6d-f）。這些發(fā)現(xiàn)提示PERP是METTL14促進(jìn)胰腺癌生長(zhǎng)的主要效應(yīng)因子。

結(jié)論：我們的研究揭示了胰腺癌中m6A甲基化水平的升高是由m6A調(diào)節(jié)劑METTL14的失調(diào)引起的。我們還通過(guò)PERP mRNA的靶向性研究了METL14在胰腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的重要作用。目前的研究不僅為胰腺癌發(fā)病機(jī)制的分子機(jī)制提供了新的見解，而且為開發(fā)針對(duì)m6A調(diào)節(jié)因子的胰腺癌更有效的治療策略鋪平了道路。