膽固醇積累減少角鯊烯環(huán)氧酶加速結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移

近日Nam-Soon Kim等人發(fā)現(xiàn)，膽固醇積累導(dǎo)致的SQLE降低通過激活catenin致癌通路和p53抑癌通路失活，加重結(jié)直腸癌（CRC）進(jìn)展。相關(guān)論文”Reduction of squalene epoxidase by cholesterol accumulation accelerates colorectal cancer progression and metastasis.”于2020年9月份發(fā)表在《Gastroenterology》雜志上。

結(jié)直腸癌(CRC)是全球第三大最常見的惡性腫瘤，大多數(shù)結(jié)直腸癌死亡與轉(zhuǎn)移有關(guān)。一些報告支持了膽固醇和CRC之間的聯(lián)系:風(fēng)險的增加與飲食和血漿膽固醇的增加有關(guān)，而風(fēng)險的降低與使用他汀抑制膽固醇合成有關(guān)。因此，膽固醇如何影響CRC值得進(jìn)一步研究，并可能提供新的治療機會。

為了獲得完全的惡性表型，腫瘤細(xì)胞需要克服幾個限制。其中包括:(1)癌基因誘導(dǎo)衰老(OIS)，這是一種不可逆的細(xì)胞周期阻滯，主要由腫瘤抑制網(wǎng)絡(luò)的誘導(dǎo)引起;(2) anoikis，即細(xì)胞/細(xì)胞/基質(zhì)相互作用被剝奪而導(dǎo)致的凋亡細(xì)胞死亡;以及(3)進(jìn)行上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的需要。腫瘤干細(xì)胞(CSCs)和EMT在轉(zhuǎn)移性CRC進(jìn)展中相互交織，共同產(chǎn)生更大的異質(zhì)性，從而加劇惡性腫瘤。遷移CSCs (MCSCs)是由靜止CSCs通過瞬時EMT誘導(dǎo)產(chǎn)生的，具有干細(xì)胞性和侵襲性，這兩種特性都是成功轉(zhuǎn)移的原因。一項研究表明，CD110和CDCP1分別是MCSCs在結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移和結(jié)直腸肺轉(zhuǎn)移中的新標(biāo)志物。角鯊烯環(huán)氧酶(SQLE)，又稱角鯊烯單加氧酶，是一種膽固醇合成的調(diào)控酶，位于3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶a還原酶(HMGCR)的下游。幾項研究已經(jīng)報道了SQLE作為一種真實的致癌基因存在于多種癌癥類型中，包括乳腺癌和肝癌。據(jù)報道，在一系列乳腺和CRC細(xì)胞系中，除了在缺氧條件下促進(jìn)癌細(xì)胞存活和增殖外，SQLE還與腫瘤驅(qū)動因子MYC共擴增。

   本文通過DNA微陣列在CRC相關(guān)基因篩選中發(fā)現(xiàn)了SQLE，并在此研究了CRC進(jìn)展中SQLE減少的功能后果。我們發(fā)現(xiàn)，SQLE的減少通過結(jié)合衰老繞過、anoikis抵抗、EMT和MCSCs的產(chǎn)生，賦予腫瘤細(xì)胞侵襲性轉(zhuǎn)移能力。

技術(shù)路線：

一、在侵襲性CRCs中，SQLE減少

   與正常組織比較，CRCs中SQLE顯著上調(diào)而HMGCR下調(diào)(圖1A-C)。

   高SQLE mRNA水平的CRC患者的中位生存至少比低SQLE水平的患者高80%(圖1D-E)。

   SQLE的顯著HR比率和E-cadherin的減少支持了高級別和高腫瘤 budding CRCs中，SQLE mRNA和蛋白水平顯著降低，且有更大的轉(zhuǎn)移傾向，這得到了顯著的SQLE HR比率和E-cadherin降低的支持(圖1F-J)。

   這些數(shù)據(jù)表明，SQLE減少是胃腸道腫瘤發(fā)展過程中一個獨特的特征。

二、膽固醇積累通過降低SQLE加速腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和侵襲性

   如果這種膽固醇在CRC腫瘤中的積累可能是我們在侵襲性CRC中發(fā)現(xiàn)的SQLE減少的原因。因此，當(dāng)膽固醇被添加到CRC細(xì)胞中時，由此導(dǎo)致的細(xì)胞膽固醇狀態(tài)的升高(圖2A)降低了SQLE水平(圖2B-C)，這與其他細(xì)胞系一致。

   當(dāng)用膽固醇、小干擾RNA對抗SQLE (siSQLE)或SQLE任務(wù)shRNA慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒(shSQLE)處理時，在模擬anoikis條件的超低親和表面(ULA)培養(yǎng)的CRC細(xì)胞顯示出更多的細(xì)胞聚集，表示細(xì)胞存活增加(圖2D-E).

   侵襲性急劇增加，上皮標(biāo)志物下調(diào)，間充質(zhì)標(biāo)志物上調(diào)(圖2F-G)

   這些觀察結(jié)果支持的異位表達(dá)SQLE減少β連環(huán)蛋白水平(圖2 h)和增加的活動TCF / LEF轉(zhuǎn)錄因子家族,其次是歸納在鋅指E-box-binding同源框1 (Zeb1 HCT116),腸道三葉草因素(也稱為TFF3, ITF HT29)和β連環(huán)蛋白在SQLE-depleted條件下(圖4 c, 5 c)。

這些數(shù)據(jù)表明，膽固醇依賴性的SQLE降低可促進(jìn)細(xì)胞存活和侵襲性，可能是通過誘導(dǎo)EMT和CSCs。

三、SQLE的減少有助于癌細(xì)胞克服細(xì)胞內(nèi)惡性轉(zhuǎn)化的限制

   與對照組相比，，多色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率明顯降低(Annexin V+)，膽固醇和sh/siSQLE-細(xì)胞凋亡中E-cadherin、p53和SQLE的水平(圖3A-C)

   蛋白印跡(圖3C)證實，在CRC細(xì)胞中，SQLE敲低與EMT同步激活有助于anoikis耐藥，其支持的原因是SQLE的異位表達(dá)阻止了siSQLE導(dǎo)致的細(xì)胞生存表型增強(圖3B-C，補充圖7B-C)。

   SQLE耗盡超過OIS，表現(xiàn)為衰老相關(guān)的半乳糖苷酶(SA- gal)活性和G1停滯(圖3D-E，補充圖5E, 5K, 7D-E)。

   Ki-67陽性細(xì)胞的數(shù)量表明，這種抑制與細(xì)胞凋亡減少和增殖增加有關(guān)(圖3F-G）。

   通過在CRC中誘導(dǎo)EMT，下調(diào)anoikis和OIS，降低SQLE可促進(jìn)CRC細(xì)胞生存和增殖。

四、SQLE還原解離GSK3 p53與p53的相互作用，導(dǎo)致GSK3抑制抑制和p53降解，從而促進(jìn)癌細(xì)胞存活

   值得注意的是，通過膽固醇處理可以觀察到(圖5A)， GSK3抑制劑CHIR99021明顯上調(diào)了Mdm2和catenin水平，同時下調(diào)了p53(在p53的第15/20個絲氨酸處降低，磷酸化降低了p53對Mdm2的親和力)，

同時抑制細(xì)胞凋亡，PARP裂解減少(圖5B)。

   同時處理膽固醇和CHIR99021進(jìn)一步提高了細(xì)胞存活率，隨后分別通過誘導(dǎo)Zeb1和ITF提高了TCF/LEF的活性(圖5C)?？紤]到TCF/LEF和Zeb1的增加可增強細(xì)胞存活率29，我們的數(shù)據(jù)證實，在SQLE耗盡時，GSK3抑制對癌細(xì)胞存活是必要的。

   SQLE與活躍的GSK3的Tyr216相互作用，但不與不活躍的GSK3的cads9相互作用(圖5D)。

   活性GSK3蛋白與SQLE的Nterminal膽固醇調(diào)節(jié)域相互作用，由融合到GFP10的前100個氨基酸組成(圖5E)，但不單獨與GFP相互作用(圖5F)。

   在SQLE過表達(dá)細(xì)胞中觀察到，GSK3的過表達(dá)增加了細(xì)胞中總膽固醇、酯化膽固醇和游離膽固醇的含量(圖5G)。

   GSK3羥色胺的異位表達(dá)顯著上調(diào)了內(nèi)源性SQLE水平(圖5H)，支持了GSK3抑制抑制降低SQLE水平的觀點(圖5B)。

   GSK3羥甲基丙烯酸酯似乎促進(jìn)了SQLE在膽固醇生物合成中的作用，可能是通過增加其穩(wěn)定性。

   我們沒有觀察到sq過表達(dá)HT29細(xì)胞中膽固醇水平的顯著升高，可能是因為這些細(xì)胞中的p53R273H可能飽和了SQLE表達(dá)，進(jìn)一步的SQLE過表達(dá)無法增加膽固醇含量(圖5G)。

   總之，活性GSK3蛋白有助于SQLE的穩(wěn)定性，從而增加細(xì)胞內(nèi)膽固醇的產(chǎn)生;SQLE下調(diào)引起的GSK3抑制抑制下調(diào)p53抑癌通路，同時激活了catenin致癌通路，使癌細(xì)胞變?yōu)橥耆珢盒浴?/span>

六、持續(xù)的高血清總膽固醇水平和SQLE降低加重了CRC的侵襲性

   與對照組的shContmice相比，我們在高膽固醇方案的小鼠和注射shsq的對照組小鼠中檢測到大量轉(zhuǎn)移性擴散(通過活細(xì)胞信號強度的顯著增加可以證明)(圖6A-6C)

   體外成像證實，長期高血清總膽固醇水平或SQLE降低可使CRC細(xì)胞局部侵襲和轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官，特別是肺(圖6D-F)

   小鼠相比，轉(zhuǎn)移性擴散顯著縮短了shCon小鼠的生存期(圖6G)

   我們沒有觀察到HCT116 p53空細(xì)胞在小鼠中的轉(zhuǎn)移性擴散(補充圖12G-K, 13I-L)，這與siSQLE-HCT116 p53null細(xì)胞中減少的catenin和Zeb1/ITF表達(dá)相關(guān)(圖4C)。

   這些數(shù)據(jù)表明，膽固醇積累以SQLE和p53依賴的方式增強轉(zhuǎn)移性擴散并縮短CRC細(xì)胞的生存時間。

七、膽固醇的積累減少了SQLE豐度，產(chǎn)生遷移的癌癥干細(xì)胞

   對單個器官，尤其是肺的病理分析顯示，SQLE敲除和高膽固醇方案均可誘發(fā)具有未分化特性的固體、非包裹性腫瘤(圖6F, 7A）

vimentin陽性強，caspase-3和組蛋白H2A免疫反應(yīng)性低，可見這些腫瘤存活，并具有遷移/侵襲和增殖特征。與對照組飲食的shcon小鼠相比(圖7B-D)

通過抑制anoikis和OIS，誘導(dǎo)EMT，高膽固醇支配和基因SQLE減少都加劇了CRC的侵襲性。

與轉(zhuǎn)移增強相一致的是，shsqle小鼠和高膽固醇方案小鼠肺內(nèi)的CDCP1均顯著升高(圖7E)

檢測到在shsql小鼠和高膽固醇組小鼠的血液中，富含上皮細(xì)胞黏附分子(EpCaM)、CD110和CDCP1的細(xì)胞百分比急劇增加。這些富集的細(xì)胞也顯示出SQLE表達(dá)的顯著減少(圖7F)

   總之，通過膽固醇積累降低SQLE在MCSCs的生成中起關(guān)鍵作用，MCSCs是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動因素。