上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響頭頸癌中鐵死亡

研究背景：鐵死亡是一種鐵依賴的脂質(zhì)過氧化引發(fā)的新型細(xì)胞死亡方式。鐵死亡是一種抑制抵抗癌癥治療的治療方法，具有上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)特性。EMT是上皮細(xì)胞打破細(xì)胞間和細(xì)胞間基質(zhì)黏附狀態(tài)的重要過程，賦予癌細(xì)胞化療耐藥性。因此，Jaewang Lee等人研究了EMT表觀遺傳重編程在促進(jìn)頭頸癌(HNC)細(xì)胞的鐵死亡中的治療潛力。（Redox Biology IF= 9.986）

技術(shù)路線圖：

研究結(jié)果：

1.細(xì)胞密度和EMT標(biāo)記物與鐵死亡敏感性相關(guān)

首先在胱氨酸耗竭培養(yǎng)條件下進(jìn)行細(xì)胞死亡試驗，確定細(xì)胞密度是否會影響鐵死亡的敏感。在HN4癌細(xì)胞中，PI陽性細(xì)胞占比與每孔細(xì)胞數(shù)負(fù)相關(guān)(圖1A和B)。細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平也隨著HN4的增加而降低(圖1 C)。結(jié)果表明，細(xì)胞密度與鐵死亡敏感性有關(guān)。檢測了6個HNC細(xì)胞系的細(xì)胞死亡證實，癌細(xì)胞密度越大，存活時間越長 (圖1D)。E-cadherin上皮標(biāo)志物在HN3、HN4、HN7和HN10中高表達(dá)，而間質(zhì)標(biāo)志物vimentin和ZEB1在HN6和HN9中高表達(dá)(圖1E)。結(jié)果表明，EMT標(biāo)記物的表達(dá)水平與鐵死亡的敏感性相關(guān)(圖1D和E)。在具有間質(zhì)性特征的HN6和HN9細(xì)胞中，鐵溶性誘導(dǎo)物RSL3暴露導(dǎo)致的細(xì)胞死亡顯著高于其他具有上皮性特征的HNC細(xì)胞系 (圖1F和G)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明向間充質(zhì)性質(zhì)的轉(zhuǎn)變可能使癌細(xì)胞更容易受到鐵胞作用的影響。

Figure1

2. E-cadherin調(diào)節(jié)鐵死亡的誘導(dǎo)

轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)處理HN3和HN4細(xì)胞，誘導(dǎo)EMT。沉默CDH1誘導(dǎo)了ZEB1和vimentin的表達(dá)(圖2A)。RSL3或磺胺嘧啶處理時，沉默CDH1使細(xì)胞更容易受到鐵死亡誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)。CDH1沉默增強了細(xì)胞死亡的增加，這與暴露于RSL3或磺胺嘧啶的癌細(xì)胞中不穩(wěn)定鐵水平的增加是同時發(fā)生的(圖2D)。CDH1過表達(dá)降低了ZEB1和vimentin在HN6細(xì)胞中的表達(dá)(圖2G)。RSL3、磺胺嘧啶或胱氨酸耗竭處理HN6細(xì)胞時，4-HNE和PTGS2表達(dá)增加，但在過表達(dá)CDH1的細(xì)胞中，增加的表達(dá)減少(圖2H)。過表達(dá)CDH1組細(xì)胞死亡降低 (圖2I)；細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵，脂質(zhì)過氧化,ROS生成的增加明顯降低(圖2 J K L); NAD/NADH比值下降 (圖2N);而GSH水平升高(圖2M)。這表明，在HN6和HN9中過表達(dá)CDH1可能增強具有間充質(zhì)特性的癌細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)。采用小鼠模型移植顯示，CDH1過表達(dá)時，腫瘤體積的減少程度低于經(jīng)磺胺嘧啶治療后的載體對照(圖2O)?；前粪奏ぬ幚砗驡SH含量降低，但NAD/NADH比值增加(圖2P Q)。綜上所述，結(jié)果表明控制E-cadherin在癌細(xì)胞中的表達(dá)可以調(diào)節(jié)鐵死亡的易感性。

Figure 2

3. ZEB1的表達(dá)改變了癌細(xì)胞對鐵死亡的敏感性

在HN6和HN9細(xì)胞中,沉默ZEB1誘導(dǎo)E-cadherin表達(dá)，抑制vimentin表達(dá)(圖3A)。暴露于RSL3或磺胺嘧啶后，細(xì)胞活力減少 (圖3B)。當(dāng)使用RSL3、磺胺嘧啶或胱氨酸耗竭時，ZEB1沉默的癌細(xì)胞中LIP、脂質(zhì)過氧化和ROS的增加也低于對照組 (圖3C-E)。ZEB1在HN3和HN4細(xì)胞中過表達(dá)，誘導(dǎo)vimentin表達(dá)并抑制E-cadherin(圖3F)。RSL3、磺胺嘧啶或胱氨酸耗竭處理HN4細(xì)胞時，4-HNE和PTGS2表達(dá)增加，但在過表達(dá)ZEB1的細(xì)胞中，表達(dá)增加顯著(圖3G)。過表達(dá)ZEB1，RSL3或磺胺嘧啶處理的pi陽性細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞存活率明顯下降 (圖3H、圖I)。LIP、脂質(zhì)ROS和胞漿內(nèi)ROS的數(shù)量，NAD/NADH比值顯著增加 (圖3J L N)。GSH水平降低(圖3M)。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)ZEB1組的腫瘤體積更小(圖3O)。過表達(dá)ZEB1組，磺胺嘧啶處理后GSH含量下降，NAD/NADH比值升高(圖3P和Q)。綜上所述，結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞中ZEB1的調(diào)控能夠調(diào)節(jié)鐵死亡的易感性。

Figure 3

4. SIRT1的激活促進(jìn)HNC細(xì)胞的鐵死亡

探討針對ZEB1的EMT的表觀遺傳重編程是否能夠調(diào)節(jié)鐵死亡。SIRT1通過激活ZEB1的功能調(diào)節(jié)EMT。在HN6和HN9癌細(xì)胞中， SIRT1沉默或Ex-527(SIRT1特異性抑制劑)處理降低了ZEB1和vimentin的表達(dá)，但增加了E-cadherin的表達(dá)(圖4A)。與暴露于RSL3或磺胺嘧啶的對照組相比，SIRT1沉默或Ex-527治療后的癌細(xì)胞細(xì)胞存活率顯著提高，細(xì)胞死亡減少 (圖4B、C)。此外，不穩(wěn)定鐵、脂質(zhì)ROS和胞漿內(nèi)ROS的增加比對照組細(xì)胞少(圖4D F)。然而，SIRT1誘導(dǎo)劑白藜蘆醇顯著降低RSL3或磺胺嘧啶處理的HN3和HN4的存活率(圖4 G)。在HN3和HN4中，RSL3或磺胺嘧啶與SIRT1特異性誘導(dǎo)劑SRT1720的組合比增加組合基質(zhì)的對照更顯著地降低了細(xì)胞存活率，特別是在高濃度組合下(圖4H和I)。SIRT1720或白藜蘆醇處理增加了ZEB1和vimentin的表達(dá)，但降低了E-cadherin的表達(dá)(圖4J)。綜上所述，這一結(jié)果表明，SIRT1在HNC癌細(xì)胞中的控制可能通過抗氧化能力減弱而影響鐵死亡的誘導(dǎo)作用。

Figure 4

5. MiR-200家族抑制劑會增加鐵死亡的易感性

miR-200家族通過抑制ZEB1抑制EMT。首先轉(zhuǎn)染miR-200家族抑制劑(圖5A)，然后在HNC細(xì)胞中檢測RSL3、磺胺拉嗪或胱氨酸耗竭后細(xì)胞存活率、LIP和ROS的生成。MiR-200家族抑制劑增加了ZEB1和vimentin的表達(dá)，但降低了E-cadherin的表達(dá)(圖5B)。mir -200a抑制細(xì)胞中，HN3和HN4的細(xì)胞活力顯著下降，而pi陽性細(xì)胞比例的增加多于對照組(圖5 C和D)。與對照組相比，使用miR-200a inhibitor的細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵、脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(圖5 E G)。結(jié)果表明, miR-200家族抑制劑在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)的EMT可能增強了對鐵死亡的敏感性。

Figure 5

6. 5-Azacitidine轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀ば再|(zhì)，減弱鐵死亡敏感性

EMT受表觀遺傳學(xué)調(diào)控，文章中確認(rèn)了EMT相關(guān)基因的甲基化水平?；虻募谆脚c蛋白質(zhì)的表達(dá)相反，如圖1E所示。CDH1的甲基化水平在間質(zhì)性的HN6和HN9中較高，而ZEB1、VIM和SIRT1的甲基化水平在上皮性的HN3和HN4中較高(圖6A)。5-Azacitidine是一種去甲基化劑，已知可以預(yù)防EMT。5-Azacitidine用RSL3或柳氮磺吡啶處理HN4和HN6。5-azacitidine治療誘導(dǎo)HN6細(xì)胞中CDH1甲基化水平降低和ZEB1，波形蛋白表達(dá)增加 (圖6 B和C)。這也導(dǎo)致了RSL3或磺胺嘧啶治療后的鐵死亡減少(圖6 D F)。在HN6細(xì)胞中，RSL3, 柳氮磺胺吡啶和胱氨酸耗竭引起的不穩(wěn)定鐵, 脂質(zhì)過氧化, 胞質(zhì)ROS的增加被5-Azacitidine減弱(圖6G I)。然而,細(xì)胞死亡和存活率、不穩(wěn)定鐵和脂質(zhì)過氧化水平在HN4之間無顯著差異。表明5-Azacitidine可能通過去甲基化上皮標(biāo)志物CDH1來降低鐵亡誘導(dǎo)劑的敏感性。

Figure 6