泛素化酶VS巨噬細(xì)胞極化

導(dǎo)語(yǔ)：巨噬細(xì)胞是先天性免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞,對(duì)宿主防御、炎癥消退和傷口愈合至關(guān)重要。巨噬細(xì)胞有促炎性和抗炎性的兩個(gè)極端。了解調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制，對(duì)于宿主防御和修復(fù)組織至關(guān)重要。泛素特異性蛋白酶19(USP19)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)錨定的去泛素化酶，調(diào)節(jié)ER相關(guān)蛋白降解和DNA損傷修復(fù)。泛素化酶與巨噬細(xì)胞極化的研究值得關(guān)注。

(IF=8.484)

技術(shù)路線

結(jié)果

1. USP19缺陷促進(jìn)鋁誘導(dǎo)腹膜炎的促炎反應(yīng)

為揭示USP19在炎癥中的作用，使用鋁鹽（明礬）誘導(dǎo)的腹膜炎模型來(lái)檢測(cè)IL-1β的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)Usp19-/-小鼠的灌洗液中IL-1β的濃度顯著高于野生型小鼠。為確定Usp19-/-小鼠IL-1β產(chǎn)生的增加是否與巨噬細(xì)胞募集的增加有關(guān)，定量灌洗液中的巨噬細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)明礬處理后Usp19-/-小鼠中巨噬細(xì)胞總數(shù)減少。因此，推斷Usp19-/-小鼠M1樣巨噬細(xì)胞和M2樣巨噬細(xì)胞之間的平衡可能發(fā)生改變。明礬處理后，Usp19-/-小鼠中M2樣巨噬細(xì)胞（F4/80 + CD11b + MR +）而非M1樣巨噬細(xì)胞（F4/80 + CD11b + CD86 +）的比例顯著降低。巨噬細(xì)胞極化與中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞募集密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)Usp19-/-小鼠中明礬誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞募集增加，嗜酸性粒細(xì)胞募集嚴(yán)重受損。這些結(jié)果證明Usp19缺陷在明礬誘導(dǎo)的腹膜炎模型中將抗炎反應(yīng)轉(zhuǎn)換為促炎反應(yīng)。

2. USP19可促進(jìn)自噬介導(dǎo)的活性氧(ROS)清除，抑制NLRP3炎癥小體的激活

鑒于USP19在明礬誘導(dǎo)的腹膜炎模型中顯著抑制IL-1β的產(chǎn)生，推測(cè)USP19可能調(diào)節(jié)炎癥小體的激活。從Usp19-/-小鼠中分離出不同的細(xì)胞類(lèi)型，發(fā)現(xiàn)在骨髓源性巨噬細(xì)胞(BMDMs)、骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDC)和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)中，Usp19缺失顯著增加ATP、明礬和二氧化硅刺激引起的IL-1β釋放，而AIM2炎癥小體激活劑誘導(dǎo)的IL-1β分泌保持不變。ATP處理的Usp19-/-小鼠BMDMs上清液中裂解的caspase-1增加。炎癥小體激活過(guò)程中，NLRP3通過(guò)PYD–PYD介導(dǎo)的相互作用觸發(fā)ASC斑點(diǎn)的形成。在USP19-KO THP-1細(xì)胞中，脂多糖LPS致敏和ATP激發(fā)的THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞中ASC斑點(diǎn)形成在炎癥小體激活后顯著增強(qiáng)，在USP19-KO THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞中敲低內(nèi)源性NLRP3，發(fā)現(xiàn)NLRP3的耗竭消除了USP19-KO細(xì)胞對(duì)LPS和ATP的IL-1β上調(diào)反應(yīng)。這些表明USP19缺陷特異性地增強(qiáng)NLRP3炎癥小體激活。

為確定USP19是否通過(guò)ROS的產(chǎn)生影響NLRP3炎癥小體的激活，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)USP19缺乏增強(qiáng)了ROS的產(chǎn)生，線粒體靶向抗氧化劑處理巨噬細(xì)胞可消除Usp19-/-巨噬細(xì)胞中IL-1β分泌的增加。這些表明，USP19的耗竭通過(guò)上調(diào)線粒體ROS產(chǎn)生增強(qiáng)NLRP3炎癥小體激活。在缺乏Beclin-1的情況下，Usp19缺失導(dǎo)致的ROS上調(diào)降低，Beclin-1的缺失消除了USP19對(duì)IL-1β分泌的影響。這些表明，USP19/Beclin-1的缺失損害了自噬，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加和隨后的NLRP3炎癥小體激活。

3. USP19對(duì)M2樣巨噬細(xì)胞極化至關(guān)重要

IL-4處理WT和Usp19-/-巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)M2樣巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物顯著降低。給小鼠腹腔注射甲殼素，發(fā)現(xiàn)從Usp19-/-小鼠獲得的腹腔中M2樣巨噬細(xì)胞比例降低，嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量也減少。這些表明USP19對(duì)甲殼素給藥后促進(jìn)M2樣巨噬細(xì)胞極化至關(guān)重要。

4. USP19阻止IRF4被p62介導(dǎo)的選擇性自噬降解

放線菌酮試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)USP19缺陷導(dǎo)致M2樣巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子IRF4顯著降解，USP19的過(guò)表達(dá)增加了NLRP3穩(wěn)定表達(dá)的人胚腎細(xì)胞中IRF4蛋白水平。自噬抑制劑、溶酶體抑制劑以及蛋白酶體抑制劑可完全抑制USP19介導(dǎo)的IRF4穩(wěn)定作用。檢測(cè)IRF4與不同受體的相互作用，發(fā)現(xiàn)IRF4與p62特異性相互作用，USP19缺陷顯著增強(qiáng)p62和IRF4之間的關(guān)聯(lián)。在Usp19-/-BM細(xì)胞中重新表達(dá)了小鼠IRF4，恢復(fù)了IL-4誘導(dǎo)的Usp19-/-BM細(xì)胞中M2樣巨噬細(xì)胞極化。這些表明USP19通過(guò)阻止IRF4被p62介導(dǎo)的選擇性自噬降解，促進(jìn)M2樣巨噬細(xì)胞極化。

5. USP19通過(guò)NLRP3穩(wěn)定IRF4

為研究USP19如何阻止p62介導(dǎo)的IRF4降解。檢測(cè)到NLRP3缺陷降低了M2樣巨噬細(xì)胞的比例，NLRP3-/-BM細(xì)胞中小鼠NLRP3的再表達(dá)恢復(fù)IL-4誘導(dǎo)的M2樣巨噬細(xì)胞極化。IL-4刺激的BM細(xì)胞中，IRF4與NLRP3相關(guān)，并且IRF4的N末端對(duì)于IRF4–NLRP3結(jié)合至關(guān)重要。Usp19缺陷通過(guò)影響NLRP3和IRF4的降解速率而降低其蛋白水平。敲除NLRP3可顯著降低USP19誘導(dǎo)的IRF4蓄積。溶酶體抑制劑單獨(dú)穩(wěn)定IRF4，加入NLRP3并不能進(jìn)一步穩(wěn)定IRF4。在自噬嚴(yán)重受損的BECN1-KO細(xì)胞中，NLRP3不能進(jìn)一步增加IRF4蛋白水平。外源性NLRP3消除了IRF4–p62相互作用，NLRP3缺陷顯著增加了IL-4誘導(dǎo)的IRF4–p62結(jié)合。這些表明NLRP3通過(guò)阻斷IRF4–p62相互作用抑制IRF4降解。

6. USP19與NLRP3相互作用并穩(wěn)定NLRP3

在BM細(xì)胞中，內(nèi)源性USP19和NLRP3直接相關(guān)，但其相互作用因炎癥小體激活而降低。NLRP3 R260W突變體是NLRP3的一種活性形式，在沒(méi)有刺激的情況下直接觸發(fā)IL-1β分泌，結(jié)合USP19的能力下降，USP19不能穩(wěn)定NLRP3 R260W突變體。在蛋白酶體抑制劑存在的情況下，USP19介導(dǎo)的NLRP3蓄積消失。USP19在K689切割NLRP3的多聚泛素鏈，抑制NLRP3的蛋白酶體降解。

總結(jié)：
1. USP19促進(jìn)自噬，清除ROS，下調(diào)NLRP3炎癥小體激活。

 2. USP19通過(guò)去除NLRP3的K689上的多聚泛素鏈，穩(wěn)定炎癥小體中未摻入的NLRP3，促進(jìn)NLRP3與IRF4的相互作用，從而阻止IRF4的p62依賴(lài)的選擇性自噬降解。