國自然熱點-自噬

2020年國自然已塵埃落定，2021年國自然申請又即將開始。那么接下來小編給大家介紹一下國自然熱點之一—自噬。自噬從2010到2017申請的相關(guān)項目一直在上升，近兩年稍有回落，但也多達500多項。其中腫瘤學(xué)相關(guān)的研究遙遙領(lǐng)先。話不多說，今天和大家分享一篇自噬相關(guān)的文章。

這篇發(fā)表于影響因子10.717的“Cell Death & Differentiation”雜志的文章“DAPK3 inhibits gastric cancer progression via activation of ULK1-dependent autophagy” 報道了DAPK3在胃癌細胞中誘導(dǎo)自噬的抑癌作用。DAPK3在GC中的抑癌作用與自噬相關(guān)，DAPK3是一種新型的自噬調(diào)節(jié)因子，可以直接磷酸化ULK1并激活ULK1。因此，DAPK3可能是一個潛在的預(yù)后的自噬相關(guān)標(biāo)志物。

結(jié)果：
1）DAPK3在胃癌細胞中顯示腫瘤抑制活性

我們前期研究表明DAPK3的表達與胃癌晚期臨床分期和不良預(yù)后呈負相關(guān)。為了深入了解DAPK3在胃癌細胞中的腫瘤抑制功能，我們進行了以下實驗。 XTT增殖試驗顯示DAPK3顯著抑制腫瘤細胞生長速率(圖1a)。病灶形成和軟瓊脂試驗顯示DAPK3顯著降低了依賴錨定和獨立細胞中的集落頻率和大小(圖1b，c)。MGC803和GES-1細胞中DAPK3的敲除強烈促進細胞生長和集落形成(圖1a-c)。為了驗證DAPK3對體內(nèi)腫瘤生長的影響，建立了皮下異種移植瘤小鼠模型。我們發(fā)現(xiàn)，空載體轉(zhuǎn)染的MKN45細胞在注射后7天內(nèi)就可以看到腫瘤，而DAPK3轉(zhuǎn)染的MKN45細胞直到注射后3周才觀察到腫瘤(圖1d)。動力學(xué)圖顯示由DAPK3沉默的MGC803細胞產(chǎn)生的腫瘤明顯大于來自對照細胞的腫瘤(圖1d)。傷口愈合和transwell試驗表明，DAPK3過表達后細胞遷移和侵襲明顯減少，DAPK3敲除后細胞遷移和侵襲增加(圖1e，f)。另外，與對照細胞相比，DAPK3過表達的MKN45和MKN28細胞顯示出G0/G1期細胞百分比的顯著增加。同時，當(dāng)DAPK3沉默時，我們觀察到MGC803和GES-1細胞中G0/G1期細胞的百分比顯著降低(圖1g)。

2）氨基酸剝奪誘導(dǎo)自噬需要DAPK3

我們研究了DAPK3是否調(diào)節(jié)胃癌細胞的自噬。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，EBSS處理促進自噬后，內(nèi)源性DAPK3蛋白水平顯著增加(圖2a)。類似地，DAPK3過表達增加了LC3-II/LC3-I比率。同時，在氨基酸饑餓條件下，SQSTM1/p62水平在DAPK3過表達的細胞中顯著降低 (圖2b)。此外，在DAPK3過表達的細胞中發(fā)現(xiàn)LC3的數(shù)量增加，表明DAPK3增強了自噬體的形成(圖2c)。透射電鏡顯示，與對照細胞相比，DAPK3過表達細胞中含有細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)和殘留消化物質(zhì)的自噬空泡顯著增加(圖2d)。MGC803和GES-1細胞中DAPK3的敲除顯著損害了LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化、SQSTM1/p62的降解、GFP-LC3的積累和氨基酸饑餓期間自噬空泡的形成(圖2d)。因此，DAPK3是誘導(dǎo)氨基酸饑餓介導(dǎo)的自噬所必需的。

3）  ATG5或ATG7缺失抑制的自噬會削弱DAPK3的腫瘤抑制功能

為了確定DAPK3介導(dǎo)的自噬是否與其腫瘤抑制功能相關(guān)，在DAPK3過表達細胞和空載體轉(zhuǎn)染細胞中，抑制ATG5或ATG7。ATG5或ATG7的敲除顯著降低了DAPK3過表達細胞中LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化、SQSTM1/P62降解和GFP-LC3形成，表明DAPK3誘導(dǎo)的自噬受到ATG5或ATG7耗竭的損害(圖3a，b)。接下來，我們研究了自噬抑制對DAPK3過表達細胞和空載體轉(zhuǎn)染細胞的細胞增殖、遷移和侵襲的影響。細胞生長試驗顯示細胞生長速率在ATG5或ATG7缺失的DAPK3過表達細胞明顯高于對照組細胞。同時，ATG5或ATG7敲除促進細胞遷移和侵襲(圖3c-e)。這些結(jié)果表明，ATG5或ATG7敲除可以挽救DAPK3誘導(dǎo)的GC細胞的生長和轉(zhuǎn)移阻滯。

4）  DAPK3通過ULK1激活調(diào)節(jié)自噬

為了闡明DAPK3介導(dǎo)的自噬的分子機制，我們使用基于質(zhì)譜的定量磷酸化蛋白質(zhì)組分析來分析在氨基酸饑餓下DAPK3過表達的MKN28細胞和對照細胞中差異表達的蛋白質(zhì)。與對照細胞相比，我們觀察到DAPK3過表達細胞中Ser556的ULK1磷酸化增加了大約兩倍。免疫印跡分析顯示氨基酸饑餓后DAPK3過表達細胞中Ser556上ULK1磷酸化水平的顯著上調(diào)(圖4a)。我們還檢測了Beclin-1的磷酸化狀態(tài)，Beklin-1是ULK1的底物，是VPS34復(fù)合物激活和完全自噬誘導(dǎo)所必需的。正如預(yù)期的那樣，DAPK3增加了Ser15的Beclin-1磷酸化，表明DAPK3調(diào)節(jié)ULK1激活(圖4a)。此外，ULK1敲除強烈抑制自噬通量、自噬體形成，并增強DAPK3過表達細胞在體外的致瘤性(圖4b-g)。在接種了ULK1沉默的MKN45-DAPK3細胞的裸鼠中，腫瘤大小顯著增加，表明DAPK3介導(dǎo)的腫瘤抑制依賴于ULK1的激活(圖4h)。

5）  DAPK3通過Ser556的直接磷酸化激活ULK1

為了研究DAPK3直接磷酸化ULK1的可能性，我們使用了GPS軟件來預(yù)測DAPK3的ULK1磷酸化位點，并發(fā)現(xiàn)ULK1可能在Ser556被DAPK3磷酸化(圖5a)。DAPK3在Ser556磷酸化重組ULK1，提示DAPK3可以直接在Ser556磷酸化ULK1(圖5b)。DAPK3還在體外激酶測定中強烈磷酸化Ser556 位點的ULK1，在氨基酸饑餓狀態(tài)下，ULK1的Ser556位點磷酸化水平進一步提高(圖5c)。然而，Ser556突變顯著阻礙了該位點的磷酸化(圖5c)。為了進一步驗證體內(nèi)ULK1中DAPK3磷酸化位點，我們通過免疫沉淀來檢測Ser556位點ULK1磷酸化。正如預(yù)期的那樣，在DAPK3過表達的細胞中觀察到高水平的ULK1 Ser556磷酸化(圖5d)。WT DAPK3過表達導(dǎo)致的Ser556 ULK 1磷酸化的增加明顯高于DAPK3 K42A過表達導(dǎo)致的增加，表明DAPK3激酶活性是ULK1 Ser556磷酸化所必需的(圖5e)。

接下來，我們將HA-ULK1作為關(guān)鍵分子進行免疫沉淀，并分析了在DAPK3過表達細胞和空載體對照細胞中ULK1和其他ULK1復(fù)合物成分之間的相互作用。DAPK3表達在饑餓條件下顯著增強了WT ULK1與其結(jié)合配偶體FIP200、ATG13和ATG101之間的相互作用，而ULK1中Ser556磷酸化位點的缺失部分削弱了這些相互作用(圖5d)。ATG101在anti-Flag免疫沉淀中被發(fā)現(xiàn)，饑餓后WT DAPK3細胞中ATG101的量增加。饑餓時，F(xiàn)IP200和ATG13與標(biāo)記的WT DAPK3共免疫沉淀(圖5e)。ULK1通過直接磷酸化Beclin1和ATG14L，有利于VPS34復(fù)合物的激活。于是我們通過蛋白質(zhì)印跡分析探討了DAPK3在VPS34復(fù)合物中的作用。研究表明，在饑餓條件下激活HEK293T細胞中的VPS34復(fù)合物需要ULK1 Ser556的磷酸化和DAPK3激酶活性(圖5f，g)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明DAPK3對ULK1的磷酸化增強了ULK1復(fù)合物的形成和饑餓時VPS34復(fù)合物的活化。

6）  ULK1中的Ser556磷酸化促進DAPK3介導(dǎo)的自噬和腫瘤抑制

為了確定ULK1磷酸化在DAPK3調(diào)節(jié)的自噬和腫瘤抑制中的功能意義，我們將WT ULK1或S556A ULK1 cDNA轉(zhuǎn)染到DAPK3過表達和空載體的MKN45細胞中。DAPK3過表達的MKN45細胞在shRNA誘導(dǎo)的內(nèi)源性ULK1下調(diào)下表現(xiàn)出自噬缺陷和致瘤性增加。WT ULK1 cDNA的重建恢復(fù)了自噬和腫瘤抑制(圖6a，c，d)。為了進一步評估UKL1磷酸化對體內(nèi)腫瘤生長的影響，我們進行了腫瘤異種移植實驗。帶有WT ULK1的DAPK3過表達MKN45細胞的異種移植物生長速度比來自S556A突變表達細胞的異種移植物生長速度慢。與空載體對照細胞相比，WT ULK1表達在DAPK 3過表達的MKN45細胞中顯示出更顯著的腫瘤生長抑制作用(圖6g)。然后我們分析了DAPK3激酶活性對自噬誘導(dǎo)和腫瘤抑制的重要性。與DAPK3 K42A細胞相比，含有DAPK3 WT的MGC803細胞顯示出更高的自噬水平和更低的細胞生長率、運動性和侵襲性(圖6b，e，f)。綜上所述， DAPK3的激酶活性和Ser556的ULK1磷酸化是DAPK3功能所必需的。

7）  DAPK3的表達與手術(shù)GC標(biāo)本中Ser556和LC3B的ULK1磷酸化呈正相關(guān)

我們的體外研究表明，DAPK3對ULK1 Ser556的磷酸化對自噬誘導(dǎo)和腫瘤抑制至關(guān)重要。相關(guān)分析表明DAPK3表達與GC組織中pULK1 Ser556和LC3B的免疫染色呈正相關(guān)(圖7a，b)。Kaplan-Meier分析顯示，DAPK3和pULK1 Ser556共表達的患者具有更長的總生存期和癌癥特異性生存期。同樣，DAPK3和LC3B的共同表達預(yù)示著患者的良好預(yù)后(圖7c，d)。這些數(shù)據(jù)表明DAPK3相關(guān)的自噬對人胃癌的進展有明顯的抑制作用。