順鉑和溶瘤病毒調(diào)節(jié)囊泡轉(zhuǎn)運，激活抗腫瘤免疫
研究背景：鉑耐藥限制了其在惡性腫瘤中的臨床應用。研究發(fā)現(xiàn)鉑耐藥是由于細胞藥物外排增加，DNA修復的激活和治療后生存途徑的誘導。已有研究報道CP和oHSV聯(lián)用在肺癌和膀胱癌中的研究，并且溶瘤性牛痘和腺病毒對卵巢癌有治療效果，美國德克薩斯大學洪邦星等人在臨床癌癥研究這一雜志上發(fā)表文章，研究了oHSV感染后癌細胞順鉑外排情況和抗腫瘤免疫。
技術(shù)路線圖：
研究結(jié)果：
1.溶瘤性HSV (oHSV)感染增加順鉑耐藥的卵巢癌細胞中順鉑的保留
感染RAMBO之后卵巢癌細胞中CP含量顯著增加(圖1B和 C)，熒光共聚焦顯微鏡顯示， RAMBO感染細胞內(nèi)觀察到的CP在細胞質(zhì)和細胞器中。文章通過RNA測序分析了RAMBO感染細胞和未感染細胞之間基因表達變化分析CP保留增加的分子機制。差異表達(DE)基因的GO和KEGG通路分析顯示，細胞外泌體相關通路中的基因存在顯著的全局失調(diào)(圖1D)。熱圖分析顯示，在感染RAMBO的細胞中，幾乎所有與細胞外泌體相關的基因均顯著下調(diào)(圖1E)。溶酶體途徑中基因表達變化的熱圖結(jié)果類似 (圖1F)。共聚焦熒光顯微鏡顯示CP與溶酶體標記LAMP-1共定位(圖1G)。這些結(jié)果說明RAMBO病毒感染導致囊泡運輸?shù)母淖?，導?/span>CP保留增加。
ATP11B和ATP7B這兩種囊泡膜蛋白與CP外排有關。感染后兩種OC細胞的ATP11B和ATP7B蛋白表達均顯著降低。單獨或聯(lián)合沉默這兩個基因可導致CP保留增加(圖1I)。當這兩個基因過表達時，OC細胞的CP保留顯著減少(圖1J)。通過外泌體/溶酶體途徑對CP的外排會受到OV感染的影響。
Figure 1
2. oHSV和CP增加DNA損傷和STING介導的免疫
在兩種不同的OC細胞系TR127和TR182中，用RAMBO處理的細胞中，cp特異性DNA加合物顯著增加(圖2A)。，聯(lián)合使用RAMBO和CP的OC細胞系中p-H2AX和p-CHK2蛋白（當DNA損傷）均有所增加(圖2B)。熒光顯微鏡分析顯示CP和RAMBO聯(lián)合處理的細胞中微核的存在有所增加(圖2C)。對四個組（細胞進行基因表達分析，發(fā)現(xiàn)控制病毒防御反應、炎癥反應和I型干擾素信號通路的基因本體論(GO)途徑顯著增加(圖2D)?；蚣患治?/span>(GSEA)也顯示，CP和RAMBO聯(lián)合處理的細胞中STING-IFN通路顯著富集(圖2E)。通過cGAMP分泌和IFN基因表達，我們發(fā)現(xiàn)與單獨治療的細胞相比，聯(lián)合使用RAMBO和CP治療的細胞cGAS/STING通路被顯著激活(圖2F和G)。
Figure2
3. RAMBO和CP共處理OC細胞激活天然抗腫瘤免疫
用CP和/或RAMBO處理原代人OC細胞，結(jié)果顯示兩種實際連用導致腫瘤細胞死亡增加 (圖3 A和B)。當聯(lián)合處理的細胞疊加到人源PBMCs, OC細胞對PBMC介導的腫瘤殺傷的敏感性顯著增加(圖3A和B)。此外，聯(lián)合培養(yǎng)腫瘤細胞的PBMCs釋放的IFN也顯著增加，說明PBMC活化增強(圖3C)。STING的激活也可以誘導腫瘤細胞上的NKG2D配體。聯(lián)合處理的OVTOKO細胞NKG2D配體表達顯著增加(圖3D)。用RAMBO和CP處理的OVTOKO細胞與人供者來源的NK細胞共培養(yǎng)，流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)CD56+ NK細胞上NKG2D表達明顯增加，IFN分泌明顯增加 (圖3E和F)。
Figure 3
4. CP和RAMBO聯(lián)合對人源性順鉑耐藥OC的體內(nèi)抗腫瘤效果
NSG小鼠腹腔內(nèi)植入表達熒光素酶和GFP的TR182細胞(TR182- luci -GFP) (圖4A) IVIS活體成像顯示，聯(lián)合使用RAMBO和CP的小鼠腫瘤負荷顯著降低(圖4B和C)。聯(lián)合治療顯示腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量和腫瘤重量顯著減少(圖4D和E)。流式細胞術(shù)分析GFP +腫瘤細胞顯示剩余腫瘤結(jié)節(jié)中腫瘤細胞的百分比顯著下降(圖4F)。通過H& E和Ki67染色對腫瘤切片進行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥的小鼠腫瘤細胞增殖減少(圖4G)。流式細胞儀對腫瘤結(jié)節(jié)的免疫表型顯示，聯(lián)合治療小鼠的CD206+ M2巨噬細胞的百分比顯著減少，而CD86+ M1巨噬細胞顯著增加(圖4H)。這些結(jié)果表明聯(lián)合治療小鼠的免疫抑制整體降低。與CP治療的小鼠相比，RAMBO治療顯著增加了腫瘤中的鉑保留。使用RAMBO和CP的小鼠腫瘤結(jié)節(jié)顯示cGAMP水平明顯高于一種試劑單獨處理(圖4J)。
Figure 4
在C57BL/6小鼠腹腔內(nèi)植入ID8 -熒光素酶(ID8-Luc)細胞，處理時間點如圖 5A。IVIS成像顯示使用RAMBO和CP治療的小鼠的腫瘤生長顯著減少(圖5B C)，小鼠的腹部腹水明顯減少(圖5D)。對小鼠的脾細胞進行分析(RAMBO后3天)，聯(lián)合治療小鼠的CD4、CD8 T細胞(圖5e)和NK細胞(圖5f)釋放的IFN細胞均有所增加。CD86+CD11c+和MHCII+CD11c+樹突狀細胞(DCs)在聯(lián)合治療小鼠中的比例也有所增加(圖5G)。
為了檢驗聯(lián)合治療對體外DC活化的影響， OVTOKO與RAMBO、CP或兩者在改良的小室中與人pbmc來源的DC細胞共培養(yǎng)。聯(lián)合治療的OVTOKO細胞共培養(yǎng)的樹突細胞的細胞質(zhì)DNA和線粒體DNA含量顯著增加(圖5H)。聯(lián)合治療后兩種OC和DC細胞中cGAS基因表達顯著增加(圖5I左圖OC, 圖5I右圖DC)。DC與聯(lián)合處理的OCs共培養(yǎng)誘導產(chǎn)生大量IFN干擾素，當樹突狀細胞敲除STING時，功能被抑制（(圖5J）。結(jié)果表明STING信號在CP和RAMBO聯(lián)合處理的OC細胞的DC反應中起重要作用。
評估DC活化對T細胞活化的影響，將經(jīng)過RAMBO和/或CP處理的OVTOKO細胞與DCs和CD3+ T細胞共培養(yǎng)96小時。當這些細胞與聯(lián)合治療的OC細胞共培養(yǎng)時，細胞的CD44+CD4+和CD44+CD8+均顯著升高(圖5K)。當T細胞和樹突狀細胞與用CP和RAMBO處理的OC細胞共培養(yǎng)時，IFN的分泌顯著增加 (圖5L)。CP和RAMBO處理的小鼠T細胞表面PD1的表達與單獨RAMBO處理相比沒有顯著變化(圖5)。
Figure 5
