國(guó)自然之m6A甲基化

m6A甲基化是近些年最火熱的研究方向之一，從2014到2019，立項(xiàng)數(shù)目一直呈上升趨勢(shì)。

今天小編給大家介紹一篇關(guān)于m6A甲基化的文章。這篇文章發(fā)表于影響因子為8.986的molecular therapy上。本文主要探究METTL3在口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)中的作用機(jī)制。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)，METTL3通過(guò)BMI1 m6A甲基化促進(jìn)OSCC增殖和轉(zhuǎn)移，提示METTL3-m6A-BMI1軸可作為OSCC患者的預(yù)后生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。
結(jié)果：

1）OSCC中m6A甲基化酶的解除

我們比較和分析了來(lái)自TCGA RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)的正常組織和OSCC組織中主要m6A甲基化相關(guān)修飾酶的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在OSCC中，METTL3和WTAP顯著上調(diào)，而METTL14的表達(dá)沒(méi)有變化(圖1A)。去甲基化酶(FTO或ALKBH5)和m6A相關(guān)閱讀蛋白(除YTHDF1外)未顯示出顯著變化(圖1B和1C)。為了進(jìn)一步證實(shí)m6A甲基化修飾酶在OSCC的表達(dá)，在OSCC及其鄰近的正?？谇徽衬そM織中進(jìn)行了qRT-PCR，結(jié)果顯示在OSCC中，METTL3、METTL14、WTAP、FTO、YTHDF1、YTHDF2和YTHDC1的表達(dá)水平明顯較高，而ALKBH5和YTHDC2的表達(dá)水平無(wú)明顯變化(圖1D-1F)。因此，我們推測(cè)OSCC病的發(fā)生可能與m6A去甲基化酶有關(guān)，尤其是METTL3的上調(diào)。

2）在OSCC，METTL3上調(diào)并與不良預(yù)后相關(guān)

為了確定METTL3在OSCC發(fā)展中的作用，在兩個(gè)OSCC隊(duì)列中進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。對(duì)于訓(xùn)練樣本集，發(fā)現(xiàn)METTL3在細(xì)胞核中表達(dá)，其表達(dá)在正常粘膜組織中很少檢測(cè)到，但在OSCC組織中顯著(圖2A)。更高的METTL3表達(dá)水平與晚期腫瘤分期、晚期臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(圖2B)。Kaplan-Meier分析顯示，METTL3高表達(dá)患者的總生存時(shí)間明顯短于METTL3低表達(dá)患者(圖2C)。此外，用ROC曲線評(píng)估了用于OSCC診斷的METTL3表達(dá)水平的潛在價(jià)值。如圖2D所示，METTL3的曲線下面積為0.729，靈敏度為65.3%，特異性為92%。在6對(duì)人類(lèi)OSCC和鄰近的非癌樣品組織中發(fā)現(xiàn)了METTL3蛋白水平和總m6A水平之間的顯著相關(guān)性(圖2E)。

3）METTL3在體外促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖、自我更新、遷移和侵襲

為研究METTL3在OSCC中的功能作用，利用METTL3 shRNA序列構(gòu)建慢病毒，建立SCC9細(xì)胞中METTL3敲除模型。結(jié)果表明METTL3在蛋白和mRNA水平均被成功敲除(圖3A)。穩(wěn)定敲除METTL3后，SCC9細(xì)胞增殖能力呈時(shí)間依賴性下降(圖3B)，遷移和侵襲能力下降(圖3C)，減少了集落(圖3D)，形成了更少更小的球體(圖3E)。此外，我們還利用慢病毒構(gòu)建了METTL3過(guò)表達(dá)系統(tǒng)，以探討METTL3在OSCC中的功能作用。在蛋白和mRNA水平上都證實(shí)了METTL3的上調(diào)(圖3F)。上調(diào)SCC9細(xì)胞中METTL3表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖能力(圖3G)和遷移侵襲能力(圖3H)。過(guò)表達(dá)METTL3的SCC9細(xì)胞的集落形成能力(圖3I)和成球能力(圖3J)也顯著增強(qiáng)。

4）METTL3在體內(nèi)促進(jìn)OSCC腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

為了研究METTL3在體內(nèi)的促癌作用，我們將METTL3敲低細(xì)胞和非靶向shRNA對(duì)照細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)。如圖4A所示，METTL3穩(wěn)定敲除組形成的腫瘤的體積和重量明顯低于對(duì)照組shRNA和敲除組。移植28天后，METTL3表達(dá)抑制腫瘤生長(zhǎng)80%。在肺轉(zhuǎn)移模型中，與注射對(duì)照shRNA感染細(xì)胞的小鼠相比，注射METTL3 shRNA感染細(xì)胞的小鼠表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量顯著減少(圖4B)。另外，我們還將METTL3過(guò)表達(dá)細(xì)胞和模擬感染細(xì)胞注射到裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)METTL3過(guò)表達(dá)組的腫瘤體積和重量明顯高于對(duì)照組(圖4C)。肺轉(zhuǎn)移模型顯示，與對(duì)照組相比，METTL3的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)顯著增加(圖4D)。此外，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型中(圖4E)，基因敲除導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著減少。METTL3過(guò)表達(dá)顯著增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此，我們得出結(jié)論，METTL3可能作為一個(gè)癌基因，促進(jìn)OSCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

5）METTL3增強(qiáng)了口腔的化學(xué)致癌作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證METTL3在體內(nèi)的致癌作用，我們將METTL3fl/fl小鼠與K14 CreER小鼠雜交，產(chǎn)生了一個(gè)它莫西芬介導(dǎo)的條件性METTL3基因KO小鼠模型。首先，為了檢查METTL3的缺失是否預(yù)防或減少4-硝基喹啉1-氧化物(4NQO)誘導(dǎo)的小鼠OSCC癌發(fā)生，在給予4NQO之前，給Mettl3cKO and Mettl3Ctrl小鼠注射tamoxifen。在最初的4NQO治療22周后，對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死(圖5A)。我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠以100%外顯率(6/6)發(fā)展為OSCC，并且僅有33.3% (2/6)的Mettl3cKO小鼠發(fā)展為輕度發(fā)育不良，這表明METTL3缺失可以降低體內(nèi)OSCC的發(fā)生率。此外，我們檢查了兩組中Ki67的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，Mettl3^cKOOSCC組中Ki67受到抑制(圖5B)。接下來(lái)，我們研究了丟失METTL3是否能抑制OSCC進(jìn)程。結(jié)果表明，在Mettl3^Ctrl和Mettl3^cKO小鼠中口腔中的臨床可見(jiàn)病變的數(shù)目是2.9±1.0和1.25±0.7(圖5E)。值得注意的是，與對(duì)照組小鼠相比，Mettl3^cKO小鼠顯示OSCC損傷面積減少，組織病理學(xué)分級(jí)降低(圖5F和5G)。一致的是，與對(duì)照組小鼠相比，Mettl3^cKO小鼠的OSCC病變的增殖活性降低(圖5H)。這些結(jié)果表明，在OSCC形成之前或之后，METTL3的損失導(dǎo)致抑制小鼠口腔區(qū)域惡性腫瘤的發(fā)展。

與之互補(bǔ)的是，我們的腫瘤發(fā)病率研究顯示，Mettl3 KI導(dǎo)致小鼠早期OSCC的出現(xiàn)(圖5K)。定量分析顯示，Mettl3^cKI小鼠的病灶數(shù)量和病灶面積均高于對(duì)照組(圖5L和5M)。4NQO處理下Mettl3^cKI小鼠舌部發(fā)生OSCC的比例為46.15%，對(duì)照組舌部?jī)H出現(xiàn)30%的OSCC形成(圖5N)。此外，與對(duì)照小鼠相比，Mettl3^cKI小鼠的增殖增加(圖5O)。這些數(shù)據(jù)表明，口腔上皮細(xì)胞中的Mettl3 KI可增強(qiáng)腫瘤易感性和惡性程度。

6）MeRIP-Seq/MeRIP-qRT PCR鑒定BMI1為METTL3下游靶點(diǎn)

為了確定OSCC的m6A分子生物學(xué)靶點(diǎn)，我們用OSCC細(xì)胞系HSC3進(jìn)行了m6A MeRIP-seq。元基因分析顯示m6A峰主要富集在翻譯終止位點(diǎn)附近(圖6A)。在OSCC細(xì)胞系中鑒定出AUGGAC基序(圖6B)。GO分析顯示m6A修飾的基因在RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)泛素化、染色質(zhì)修飾和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)中是豐富的(圖6C)，這表明m6A可能對(duì)OSCC有深遠(yuǎn)的影響?？梢暬治鲲@示m6A峰富集在BMI1基因的終止密碼子附近(圖6D)。此外，MeRIP-qRT PCR分析顯示，BMI1 m6A 修飾在敲除METTL 3后顯著降低(圖6E)，而在METTL 3過(guò)表達(dá)時(shí)升高(圖6F)，這表明在OSCC m6A修飾可以調(diào)節(jié)BMI1。

7）METTL3介導(dǎo)的m6A修飾促進(jìn)了BMI1 mRNA的翻譯，增強(qiáng)了OSCC的增殖和轉(zhuǎn)移

為了研究OSCC BMI 1 m6A修飾的分子機(jī)制，我們首先在SCC9細(xì)胞中敲除了METTL3，發(fā)現(xiàn)METTL3的敲除降低了BMI1蛋白的表達(dá)，而沒(méi)有改變其基因水平(圖7A和7B)，這表明METTL3可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)BMI1的表達(dá)。事實(shí)上，敲除METTL3顯著降低了BMI1基因在主動(dòng)翻譯的多聚體部分中的比例(圖7C)，但對(duì)其基因穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)降解率幾乎沒(méi)有影響(圖7D-7F)，這表明METTL3介導(dǎo)的m6A修飾是BMI1基因有效翻譯所必需的。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在SCC9細(xì)胞中過(guò)表達(dá)METTL3增加了BMI1蛋白的表達(dá)(圖7G)，但沒(méi)有增加其mRNA水平(圖7H)。METTL3過(guò)表達(dá)增加了多聚體結(jié)合BMI1基因的水平(圖7I)，但沒(méi)有改變BMI1基因的穩(wěn)定性或蛋白質(zhì)降解率(圖7J–7L)。因此，這些數(shù)據(jù)揭示了在OSCC中，METTL3介導(dǎo)的m6A修飾促進(jìn)了BMI1 mRNA的翻譯。此外，與對(duì)照組相比，BMI1的表達(dá)在Mettl3^cKO OSCC中受到抑制(圖5C和5I)，而BMI1的表達(dá)在Mettl3^cKO OSCC小鼠中與對(duì)照組相比有所增加(圖5P)。

8）METTL3識(shí)別BMI1 3’ UTR上的m6A殘基，并在與m6A reader IGF2BP1的合作下促進(jìn)BMI1翻譯

為了進(jìn)一步探索OSCC BMI1 m6A介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告子和誘變分析。如圖8A和8B所示，與用攜帶突變BMI1 3’UTR (Mut3，Mut4)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用野生型BMI1 3’UTR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯著增加了熒光素酶活性，并且與METTL3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也顯著增加了熒光素酶活性。接著，為了了解m6A讀碼器如何在OSCC中促進(jìn)BMI1翻譯，用不同siRNA的m6A讀碼器轉(zhuǎn)染SCC9細(xì)胞。如圖8C–8F所示， BMI1蛋白的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染IGF2BP1 siRNA的SCC9細(xì)胞中顯著降低(圖8D)。此外，IGF2BP1敲除降低了METTL3過(guò)表達(dá)SCC9細(xì)胞中BMI1蛋白水平(圖8E)。此外，敲除METTL3和/或IGF2BP1協(xié)同降低BMI1蛋白水平(圖8F)。綜上所述，在與IGF2BP1的合作下，METTL3促進(jìn)了BMI1在OSCC中的翻譯。