高分文章的奧秘：piRNA聯(lián)合m6A甲基化

導語：彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL) 淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤中最常見的亞型，其發(fā)生和進展受遺傳和表觀遺傳畸變控制。作為真核信使RNA最豐富的化學修飾，N6-甲基腺苷(m6A)通過調(diào)節(jié)靶基因表達影響各種基本的生物過程。PIWI相互作用RNA(piRNA)是一類非編碼RNA，piRNA可通過調(diào)控DNA甲基化引導PIWI蛋白沉默轉(zhuǎn)座因子。piRNA和m6A甲基化聯(lián)合起來，一篇高分文章新鮮出爐。

(IF=17.543)

技術(shù)路線

結(jié)果
1. piRNA-30473在DLBCL中升高，是DLBCL患者的不良預后因素
首先微陣列分析檢測石蠟包埋DLBCL組織中小RNA的表達水平，鑒定出4個顯著失調(diào)表達的piRNA。取來自42例其他DLBCL患者組織，進一步證實4種piRNA在DLBCL患者中的表達。發(fā)現(xiàn)，預后不良患者的piRNA-30473表達水平顯著升高?？ㄆ仗m-梅爾分析顯示DLBCL患者中高piRNA-30473水平與較差的生存相關(guān)piRNA-30473可作為預后的生物標志物。

2. piRNA-30473的抑制降低了DLBCL的增殖和腫瘤發(fā)生
進一步探索piRNA-30473在DLBCL中的功能作用，在人DLBCL細胞中使用antagomir-30473敲除piRNA-30473，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，DLBCL細胞中piRNA-30473的缺失導致細胞增殖減少（圖2A，S1B）。細胞周期分析顯示，抑制DLBCL細胞中的piRNA-30473可增強G1期細胞，減少S期和G2期細胞（圖2B、2 C、S1 C、S1D）。然而，piRNA-30473的缺失并不能誘導細胞凋亡（圖2D和S1E）。
此外，構(gòu)建SU-DHL-8異種移植DLBCL模型，以評估piRNA-30473對體內(nèi)DLBCL進展的影響（圖2E）。與對照組相比，antagomir-30473給藥導致腫瘤體積顯著減小（圖2F）。
這些表明，沉默piRNA-30473在體內(nèi)外抑制細胞活性

3. piRNA-30473通過調(diào)節(jié)WTAP的表達介導m6A甲基化
進一步探索piRNA-30473在DLBCL表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用，在antagomir-30473轉(zhuǎn)染后檢測整體m6A甲基化水平，發(fā)現(xiàn)antagomir-30473轉(zhuǎn)染細胞中的整體m6A水平降低，沉默piRNA-30473可降低RNA甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP的表達。antagomir-30473處理部分降低了DLBCL異種移植模型中的WTAP表達。
研究表明，WTAP介導METTL3和METTL14募集到mRNA靶標。免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)antagomir-30743處理降低了WTAP與METTL3和METTL14的關(guān)聯(lián)。通過miRNA特異性靶標檢測算法miRanda，發(fā)現(xiàn)piRNA-30473在WTAP的3’UTR內(nèi)有一個結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因檢測進一步驗證WTAP是piRNA-30473的定向靶基因，敲除piRNA-30473導致WTAP mRNA的穩(wěn)定性下降。基于這些觀察結(jié)果，得出結(jié)論，piRNA-30473通過與WTAP的3’UTR結(jié)合，減少WTAP mRNA衰變，然后增強mRNA穩(wěn)定性。

4. WTAP在DLBCL中起致癌作用
接下來研究WTAP在DLBCL的臨床效應，免疫組織化學評估發(fā)現(xiàn)WTAP在預后不良的患者中高表達， GEO數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)WTAP的高表達預示著預后不良。
深入了解WTAP調(diào)控DLBCL發(fā)展和預后的機制，發(fā)現(xiàn)彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞中敲低WTAP產(chǎn)生的效應和piRNA-30473敲低相似，整體m6A水平降低，生長抑制和細胞周期停滯，細胞凋亡無變化。在下調(diào)piRNA-30473的細胞中恢復WTAP的表達，在很大程度上逆轉(zhuǎn)已改變的生物活性。以上數(shù)據(jù)表明WTAP是piRNA-30473功能上重要的靶點，并在DLBCL中發(fā)揮致癌作用。

5. RNA-seq和m6A-seq鑒定WTAP靶標
為進一步驗證WTAP介導的m6A甲基化對DLBCL細胞的影響，對對照組和WTAP敲除的SU-DHL-8細胞進行m6A-seq。與已發(fā)表研究一致，發(fā)現(xiàn)共有基序DRACH富集在免疫純化的RNA中。m6A-seq在對照和WTAP缺陷細胞中鑒定出17274和1900個m6A峰，m6A位點主要在外顯子和3’UTRs中發(fā)現(xiàn)， m6A殘基最高富集于終止密碼子附近。
RNA-seq發(fā)現(xiàn)186個轉(zhuǎn)錄本顯著下調(diào)，而318個轉(zhuǎn)錄本顯著上調(diào)。由于WTAP是一種m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，WTAP敲除后攜帶低甲基化m6A峰的轉(zhuǎn)錄本可能是WTAP的靶標。過濾差異表達基因中發(fā)生的低甲基化m6A峰，鑒定出136個基因；檢測了DLBCL患者樣本中WTAP與上述基因的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)28個基因的表達與DLBCL中的WTAP相關(guān)。在所有數(shù)據(jù)集中，只有HK2與WTAP顯著相關(guān)。編碼己糖激酶2的HK2有助于腫瘤的高糖酵解率，DLBCL低氧應激時促進生長需要HK2，提示HK2是DLBCL中WTAP的關(guān)鍵靶基因。m6A-seq數(shù)據(jù)表明WTAP靶向HK2轉(zhuǎn)錄本的5’UTR，WTAP敲低引起HK2 5’UTR的m6A水平顯著下降。
敲低WTAP后，細胞的m6A水平顯著下調(diào)；發(fā)現(xiàn)WTAP敲除顯著降低了pGL3-HK2-WT野生型載體的熒光素酶活性（pGL3-HK2-WT載體具有完整的m6A位點），而m6A位點的突變則消除這種抑制。用CRISPR/Cas9敲除HK2 5’UTR上的WTAP結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)HK2上m6A RNA甲基化位點的缺失逆轉(zhuǎn)了WTAP介導的表型變化，證實WTAP/HK2軸在DLBCL中的機制作用。
使上述結(jié)果表明HK2是DLBCL中WTAP的直接下游靶點。

6. m6A RNA閱讀器IGF2BP2對于HK2的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)至關(guān)重要
IGF2BPs是成熟的m6A閱讀器，可識別哺乳動物細胞中數(shù)千個甲基化轉(zhuǎn)錄本。m6A-seq結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF2BP結(jié)合位點位于HK2的5’UTR。
IGF2BP2缺陷細胞中HK2的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，穩(wěn)定性往往較差。熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步證實IGF2BP2靶向HK2 mRNA的5’UTR。
綜上所述得出結(jié)論，RNA結(jié)合蛋白IGF2BP2與WTAP共同發(fā)揮作用，影響DLBCL細胞中HK2 mRNA的穩(wěn)定性和表達。

總結(jié)：1. m6A修飾機制在DLBCL中至關(guān)重要；
           2. piRNA-30473通過WTAP/HK2軸調(diào)控m6A甲基化，進而調(diào)控腫瘤發(fā)生和疾病進展。