circCUL2調(diào)控胃癌的惡性轉(zhuǎn)化和順鉑耐藥

circRNAs是一類非編碼RNAs，可通過與miRNA結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá)；此外，circRNAs已經(jīng)被證明參與了幾個(gè)病理過程。然而circCUL2在胃癌(GC)中的表達(dá)及生物學(xué)功能尚不清楚。那么小編為大家?guī)斫诎l(fā)表于影響因子15.302的“Molecular Cancer”上的文章“circCUL2 regulates gastric cancer malignant transformation and cisplatin resistance by modulating autophagy activation via miR-142-3p/ROCK2”，為大家詳細(xì)介紹circCUL2在胃癌中的作用和具體分子機(jī)制。

我們發(fā)現(xiàn)circCUL2在GC組織和細(xì)胞系中下調(diào)。circCUL2抑制GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，circCUL2在耐順鉑GC細(xì)胞系中下調(diào)，并調(diào)節(jié)了順鉑的敏感性。circCUL2可能通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-142-3p、調(diào)節(jié)ROCK2表達(dá)和自噬激活，參與腫瘤發(fā)生和化療耐藥性。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）  circCUL2在GC組織和細(xì)胞中的表達(dá)和特征

我們應(yīng)用芯片技術(shù)來探索幾種circRNAs在胃癌組織和鄰近組織之間的差異表達(dá)?；诓町惐磉_(dá)的基因以及GO和KEGG分析結(jié)果，我們選擇circCUL2進(jìn)行進(jìn)一步研究。與成對(duì)的非癌組織相比，胃癌組織中circCUL2的表達(dá)明顯降低(圖1a)。通過ROC分析circCUL2對(duì)GC的診斷價(jià)值，ROC曲線下面積為0.790 (圖1b)。Kaplan-Meier分析顯示circCUL2水平低的胃癌患者總生存率較差(圖1c)。然后，通過qRT-PCR檢測(cè)，與正常血清相比，GC血清中circCUL2水平明顯降低(圖1d)。此外，AGS和SGC-7901細(xì)胞株中的circCUL2水平降低，選擇進(jìn)行進(jìn)一步研究(圖1e)。

隨后，我們通過Sanger測(cè)序?qū)ircCUL2 qRT-PCR產(chǎn)物序列進(jìn)行了驗(yàn)證，靶區(qū)為頭尾剪接位點(diǎn)，序列與circBase數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列一致(圖1f)。circCUL2可以抵抗RNase R的處理(圖1g-i)，聚合引物擴(kuò)增的線性CUL2被RNase R消化(圖1g-i)。此外，在經(jīng)轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D處理的AGS和SGC-7901細(xì)胞系中，CUL2的線性轉(zhuǎn)錄本的半衰期比circCUL2短(圖1j)。核質(zhì)RNA qRTPCR和FISH抗circCUL2的結(jié)果顯示，circCUL2優(yōu)先定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖k-l)。這些結(jié)果表明circCUL2可能參與了GC的發(fā)生發(fā)展，circCUL2穩(wěn)定且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。

2）  circCUL2抑制GC細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化

為了進(jìn)一步探究circCUL2對(duì)GC細(xì)胞的功能作用，我么利用RNA干擾和過表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)(圖2a)。CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)證實(shí)circCUL2下調(diào)增強(qiáng)了GC細(xì)胞的增殖能力(圖2b-c)。circCUL2抑制也增強(qiáng)了對(duì)菌落形成的影響(圖2d)。此外，通過Transwell和傷口愈合檢測(cè)細(xì)胞遷移，發(fā)現(xiàn)circCUL2特異性siRNA增加了細(xì)胞遷移(圖2e和f)。在circCUL2過表達(dá)的細(xì)胞中，細(xì)胞浸潤(rùn)被抑制，而在circCUL2表達(dá)降低的細(xì)胞中，細(xì)胞浸潤(rùn)被促進(jìn)(圖2f)。過表達(dá)circCUL2則產(chǎn)生相反的效果，它抑制了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲(圖2b-f)。

3）  circCUL2作為miR-142-3p海綿

circCUL2的細(xì)胞質(zhì)定位提示circCUL2可能在轉(zhuǎn)錄后水平參與了GC的發(fā)展。為了研究選擇性剪接機(jī)制，我們檢測(cè)了CUL2在GC組織中的線性表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示CUL2在GC組織中升高，但與circCUL2無相關(guān)性(圖3a-b)。此外，抑制或過表達(dá)circCUL2均不會(huì)改變線性CUL2的mRNA表達(dá)水平(圖3c)。在排除了選擇性剪接機(jī)制后，我們下一步研究了circCUL2結(jié)合miRNAs的能力。CircInteractome和circRNABase工具用于預(yù)測(cè)可能與circCUL2序列結(jié)合的潛在靶標(biāo)miRNAs(圖3d)。結(jié)合GC組織的miRNA芯片(圖3e)，選擇miR-142-3p和miR-653。在circCUL2 siRNA或circCUL2過表達(dá)質(zhì)粒處理的細(xì)胞中，只有miR-142-3p水平升高或降低(圖3f)。然后，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能分析，篩選出miRanda、miRBridge、PicTar、PITA和TargetScan預(yù)測(cè)的miR-142-3p的靶基因(圖3g)。只有ROCK2被發(fā)現(xiàn)受到circCUL2和miR-142-3p的調(diào)控(圖3h)?；谶@些結(jié)果，我們推測(cè)circCUL2可能作為miR142-3p海綿調(diào)節(jié)ROCK2。

4）  體內(nèi)circCUL2、miR-142-3p和ROCK2的表達(dá)

為了研究circCUL2、miR-142-3p和ROCK2在體內(nèi)的作用，我們對(duì)circCUL2和miR-142-3p在GC組織中的作用進(jìn)行了FISH檢測(cè)。結(jié)果顯示，circCUL2和miR-142-3p共局域化，表達(dá)相反(圖4a)。在GC組織中，miR142-3p的miRNA水平顯著上調(diào)(圖4b)，而ROCK2的mRNA和蛋白水平顯著降低(圖4c-d)。此外，miR-142-3p與circCUL2或ROCK2表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，而circCUL2和ROCK2表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(圖4e-g)。接著，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染circCUL2OE或空載體的細(xì)胞皮下接種于裸鼠，密切監(jiān)測(cè)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)4周。我們的結(jié)果表明，來自circCUL2-OE細(xì)胞的腫瘤明顯小于來自空載體-的腫瘤轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖4h)的體積和重量(圖4i-j)?；贔ISH(圖4k)觀察了circCUL2和miR-142-3p的共定位。

5）  circCUL2在體外通過miR-142-3p/ROCK2調(diào)控惡性轉(zhuǎn)化

在體外我們進(jìn)一步研究了circCUL2/miR-142-3p/ROCK2是否能夠調(diào)控腫瘤的發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè)circCUL2和ROCK2可以與miR-142-3p結(jié)合(圖5a)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，miR-142-3p可以直接結(jié)合circCUL2和ROCK2的3'UTR位點(diǎn)(圖5b)。RNA下拉結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，circCUL2特異性探針下拉樣品中circCUL2和miR-142-3p顯著富集(圖5c)。接下來，我們?cè)贏GS和SGC-7901細(xì)胞系中使用抗AGO2抗體進(jìn)行RIP。結(jié)果顯示circCUL2和miR-142-3p被抗AGO2抗體沉淀后顯著富集(圖5d)。此外，我們還探討了circCUL2/miR-142-3p調(diào)控GC進(jìn)展的潛在機(jī)制。miR-142-3p模擬物或circCUL2 siRNA誘導(dǎo)的ROCK2 mRNA和蛋白水平下降，分別通過過表達(dá)circCUL2或轉(zhuǎn)染miR-142-3p抑制劑逆轉(zhuǎn)(圖5e和f)。此外，在AGS和SGC-7901細(xì)胞中過表達(dá)miR-142-3p可提高增殖率(圖5gh)、遷移能力和侵襲能力(圖5j-k)。為了進(jìn)一步確定circCUL2是否通過與miR-142-3p相互作用發(fā)揮其功能，我們將miR-142-3p模擬物和circCUL2表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到GC細(xì)胞中。過表達(dá)circCUL2的細(xì)胞中，miR-142-3p對(duì)GC細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)促進(jìn)的影響被逆轉(zhuǎn)(圖5g-k)。這些數(shù)據(jù)表明circCUL2通過吸附miR-142-3p抑制GC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

6）  circCUL2調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

由于circCUL2下游的miR-142-3p和ROCK2可能與胃癌預(yù)后相關(guān)，我們分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)miR-142-3p的高表達(dá)和ROCK2的低表達(dá)可導(dǎo)致無病生存(DFS)或DFS聯(lián)合化療縮短(圖6a-b)。提示circCUL2可能參與了GC細(xì)胞的化療耐藥性。因此，我們篩選順鉑、5-FU、DOX和MMC，以確定circCUL2對(duì)其敏感性影響最大的藥物。結(jié)果顯示，升高的circCUL2主要抑制順鉑處理的細(xì)胞活力，而降低的circCUL2主要誘導(dǎo)順鉑耐藥(圖6c)。干擾circCUL2可以提高IC50，而過表達(dá)circCUL2可以降低IC50(圖6d)。

為了驗(yàn)證circCUL2調(diào)控順鉑敏感性的假設(shè)，我們構(gòu)建了順鉑耐藥AGS/DDP和SGC-7901/DDP細(xì)胞系。與正常GC細(xì)胞系相比，順鉑耐藥GC細(xì)胞系circCUL2和ROCK2表達(dá)顯著降低，miR142-3p表達(dá)顯著升高(圖6e)。隨后，共轉(zhuǎn)染miR-142-3p模擬物和circCUL2表達(dá)構(gòu)建物后，順鉑處理AGS/DDP和SGC-7901/DDP細(xì)胞系。當(dāng)細(xì)胞過表達(dá)miR-142-3p時(shí)，circCUL2誘導(dǎo)的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用被逆轉(zhuǎn)(圖6f-i)。此外，異種移植瘤數(shù)據(jù)顯示，高水平的circCUL2顯著降低了異種移植瘤的生長(zhǎng)，并使細(xì)胞對(duì)順鉑治療敏感(圖6j-k)。qRT-PCR結(jié)果顯示，circCUL2的上調(diào)可顯著誘導(dǎo)circCUL2和ROCK2的mRNA水平，而異種移植標(biāo)本中miR-142-3p的水平則受到抑制(圖6l)。這些數(shù)據(jù)表明，過表達(dá)的circCUL2通過吸附miR-142-3p促進(jìn)順鉑的敏感性。

7）  circCUL2通過靶向順鉑耐藥GC細(xì)胞中的miR-142-3p抑制自噬

自噬與miR-142-3p和ROCK2的差異表達(dá)相關(guān)。circCUL2提高了順鉑在GC中的敏感性，因此我們有興趣研究circCUL2是否通過miR-142-3p在AGS/ DDP和SGC-7901/DDP細(xì)胞系中抑制自噬。與預(yù)期一樣，WB分析顯示，過表達(dá)circCUL2增加了ROCK2和p62的表達(dá)，而miR-142-3p模擬物則挽救了它們(圖7a)。此外，circCUL2抑制了自噬活性的標(biāo)記物L(fēng)C3和Beclin1的表達(dá)，但在順鉑耐藥的GC細(xì)胞中過表達(dá)miR-142-3p時(shí)，這種作用被逆轉(zhuǎn)(圖7a)。與模擬細(xì)胞相比，外源GFPLC3B質(zhì)粒預(yù)處理后的DDP處理細(xì)胞中，GFP-LC3B斑點(diǎn)顯著增加，表明自噬小泡形成(圖7b)。此外，過表達(dá)circCUL2的細(xì)胞自噬小泡的形成比載體處理的細(xì)胞少。自噬小泡形成的減少可以被miR-142-3p模擬物逆轉(zhuǎn)(圖7b)。同樣，免疫熒光法計(jì)算的LC3蛋白表達(dá)量(圖7c)和透射電鏡觀察的自噬小體數(shù)(圖7d)與GFP-LC3B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果的趨勢(shì)相同。因此，這些結(jié)果表明circCUL2通過miR-142-3p/ROCK2在順鉑耐藥GC細(xì)胞中抑制自噬。

結(jié)論：circCUL2可能通過miR-142-3p/ROCK2介導(dǎo)的自噬激活作為腫瘤抑制因子和順鉑敏感性調(diào)控因子，可能是胃癌的關(guān)鍵機(jī)制和治療靶點(diǎn)。