MGMT基因重排有助于膠質(zhì)瘤化療耐藥
近月來，一篇名為“ MGMT genomic rearrangementscontribute to chemotherapy resistance in gliomas ”，發(fā)表在《Nature Communications》上，由CNIO的Seve Ballesteros基金會腦腫瘤小組負責人MassimoSquatrito博士和北京神經(jīng)病學研究所的Tao Jiang博士（醫(yī)學博士）領(lǐng)導。
“ MGMT啟動子高甲基化是膠質(zhì)母細胞瘤患者中唯一已知的TMZ反應(yīng)生物標記。在這里，我們顯示，復發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一個子集攜帶MGMT基因組重排，導致MGMT過表達，與其啟動子甲基化的變化無關(guān)。通過利用CRISPR / Cas9技術(shù)，我們在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中產(chǎn)生了一些MGMT重排，并證明MGMT基因組重排在體外和體內(nèi)均對TMZ產(chǎn)生了抗性?！?/span>
研究人員說：“在一組患者中觀察到了MGMT基因的移位?！?nbsp;這些基因組重排涉及MGMT與其他基因的融合，這意味著MGMT現(xiàn)在受到與其融合的啟動子的調(diào)控，這有助于其過度表達。當這種類型的重排發(fā)生時，替莫唑胺誘導的DNA損傷得到了非常有效的修復，并且即使在治療下，神經(jīng)膠質(zhì)瘤也繼續(xù)增長。
為了揭示神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的TMZ耐藥情況，研究人員分析了252例經(jīng)TMZ治療的復發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的RNA測序數(shù)據(jù)，其中新收集了105例（42％）。然后，該團隊整合了臨床信息并進行了生物信息學分析，以確定幾種關(guān)鍵改變的突變狀態(tài)。CNIO小組使用CRISPR-Cas9在不同的細胞和動物模型中復制了其中的一些易位，并證實它們可以賦予對替莫唑胺的抗性。研究人員補充說：“似乎在原始腫瘤中不存在易位，僅在復發(fā)性腫瘤中存在，即在治療原始癌癥后出現(xiàn)的腫瘤?！?nbsp;“這表明抗藥性可能是治療本身的結(jié)果?！?nbsp;
他們的發(fā)現(xiàn)可能會導致監(jiān)測治療效果的方法發(fā)生變化：“目前，膠質(zhì)瘤中唯一已知的治療生物標志物是對MGMT啟動子狀態(tài)的分析。甲基化后，MGMT基因沉默，預計患者對替莫唑胺有反應(yīng)。研究表明，當發(fā)生基因易位時，該方法不再有效。該啟動子可能仍然被阻斷，但是該基因被其他啟動子過度激活，因此可能導致腫瘤復發(fā)?！?/span>
研究人員還發(fā)現(xiàn)外泌體中存在MGMT易位。研究人員指出，如果這一發(fā)現(xiàn)在患者中得到了驗證，那么它將有助于早期發(fā)現(xiàn)耐藥性。研究人員的下一個目標是為替莫唑胺耐藥的患者確定新的治療手段。
總而言之，替莫唑胺(TMZ)是一種口服烷基化劑，用于治療膠質(zhì)母細胞瘤，目前正在成為診斷為高危低級別膠質(zhì)瘤患者的化療選擇。o -6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)負責直接修復主要tmz誘導的毒性DNA加合物，即o6 -甲基鳥嘌呤病變。MGMT啟動子高甲基化是目前已知的膠質(zhì)母細胞瘤患者TMZ反應(yīng)的唯一生物標志物。此文章表明復發(fā)性膠質(zhì)瘤的一個子集攜帶MGMT基因組重排，導致MGMT過表達，獨立于其啟動子甲基化的變化。通過利用CRISPR/Cas9技術(shù)，我們在膠質(zhì)瘤細胞中產(chǎn)生了一些MGMT重排，并證明MGMT基因組重排在體內(nèi)和體外都有助于TMZ耐藥。最后，證明了這種融合可以在腫瘤來源的外泌體中檢測到，并可能代表接受TMZ治療的患者中腫瘤復發(fā)的早期檢測標志物。
技術(shù)路線：
結(jié)果：
一、復發(fā)性膠質(zhì)瘤中MGMT基因融合的鑒定
通過分析252例復發(fā)性腦膠質(zhì)瘤的RNA-seq數(shù)據(jù)，我們在7例患者中確定了8種不同的MGMT融合(約占所有患者的3%，95%可信區(qū)間，1.1 5.6%)。值得注意的是，在7例合并MGMT融合的患者中，有6例是女性，這明顯高于預期。重要的是，bootstrapping方法顯示MGMT低甲基化、DNA高突變和MGMT融合之間存在著顯著的相互排他性，表明這些變化在癌癥進展中發(fā)揮著替代作用.
A. 總的來說，我們發(fā)現(xiàn)38.4%(245例)患者存在IDH1突變，9.4%(23例)患者存在1p/19q共缺失，38%(136例)患者存在MGMT啟動子低甲基化，10.7%(27例)患者存在DNA高突變.
B. 對8種不同的MGMT重排進行了深入研究:HGG中的BTRC-MGMT、CAPZB-MGMT、GLRX3-MGMT、NFYC-MGMT、RPH3A-MGMT和SAR1A-MGMT, LGG中的CTBP2- MGMT和FAM175B-MGMT. 8個伴侶基因中的5個位于染色體10q上，大部分接近MGMT
C. 盡管MGMT融合的左伴子不同，但MGMT轉(zhuǎn)錄組斷點始終位于MGMT起始密碼子上游12 bp處的MGMT外顯子2的邊界上。在三種重排(SAR1A-MGMT、RPH3A-MGMT和CTBP2-MGMT)中，MGMT編碼序列融合到融合伙伴的5 UTR上。重組嵌合轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)所有融合體均在框內(nèi)，MGMT的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域均完整，提示MGMT的功能可能保留在融合蛋白中。
D-E我們利用PCR和Sanger測序在有足夠標本的樣本中驗證了基因融合。對于一個患者(CGGA_1729)，我們進行了全基因組測序(WGS)，該樣本的結(jié)構(gòu)重排分析顯示，大約4.8 Mb的缺失導致FAM175B-MGMT融合.
二、MGMT基因重排導致MGMT過表達
A.為了產(chǎn)生攜帶MGMT融合的細胞系，我們首先將U251和U87細胞，兩種MGMT甲基化的GBM細胞系，與慢病毒載體表達不同的gRNA對組合，指向四種不同的MGMT重排:BTRC-MGMT、NFYC-MGMT、SAR1A-MGMT和CTBP2-MGMT(補充圖2a c)。
通過PCR在基因組水平檢測到預期的染色體重排，并通過Sanger測序證實。然后將新生成的細胞群暴露于TMZ中。存活的克隆只在攜帶不同融合事件的細胞群體中觀察到，而在對照細胞中沒有觀察到(sgCtrl，非靶向sgRNA).
B.TMZ耐藥可能是由于MGMT表達增加導致的，因為重排將MGMT基因置于一個更活躍的啟動子控制之下。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，MGMT在攜帶不同融合體的無性系中表達量顯著增加。
與對照細胞相比，MGMT啟動子甲基化狀態(tài)沒有變化，甲基化特異性PCR (MSP)證實了這一點。這些結(jié)果與在患者隊列中觀察到的結(jié)果一致:MGMT重排的患者顯示MGMT表達升高，同時MGMT啟動子甲基化。
使用抗gmt抗體進行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)MGMT在蛋白水平上明顯過表達，SAR1A-MGMT和CTBP2-MGMT融合克隆尤其明顯(圖2d)。此外，MGMT表達的不同水平可能由參與融合事件的特定基因s啟動子的活性和/或每個特定克隆基因組重排列的拷貝數(shù)決定。
為了確定攜帶融合基因的克隆對TMZ的抗性是否由一種全功能MGMT蛋白的過表達決定，而不是由TMZ治療過程中獲得的其他突變引起的，我們分析了O6-芐基鳥嘌呤(O6- bg)對TMZ的敏感性，O6- bg是鳥嘌呤的一種合成衍生物，可抑制MGMT活性。
A.對2個獨立的U251克隆進行克隆實驗，結(jié)果表明，與O6-BG共處理后，TMZ的敏感性得以恢復。
B-D.相比之下，錯配修復基因MSH6(一種獨立于MGMT表達的tmz耐藥機制)的細胞敲除在O6-BG存在下也完全耐TMZ。同樣，碘化丙啶染色和EdU摻入分析顯示融合克隆避開了tmz誘導的G2/M期積累，O6-BG共處理能夠重新建立細胞周期停滯。
E-F.高通量顯微鏡定量分析顯示，與sgRNA MSH6細胞相似，TMZ處理未增加γH2AX和53BP1病灶水平，這是DNA雙鏈斷裂細胞特有的DNA損傷標志物.
總之，O6-BG抑制MGMT導致TMZ處理后融合克隆中γH2AX和53BP1焦點的積累。MGMT基因重排誘導的TMZ抗性與MGMT活性存在機制方面的聯(lián)系。
四、MGMT基因融合在體內(nèi)對TMZ治療有保護作用
通過U251 BTRC-MGMT和對照細胞建立nu/nu小鼠異種移植模型，體內(nèi)MGMT融合的TMZ耐藥性，之前用表達熒光素酶的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染。顱內(nèi)移植后1周，小鼠腹腔注射TMZ (50 mg/ Kg)或DMSO(0.3%) 5天，每周用生物熒光成像(BLI)監(jiān)測腫瘤生長情況，連續(xù)4周。
AMGMT帶有融合腫瘤的小鼠在TMZ組和DMSO組之間沒有顯示出顯著的壽命延長，并且在接受TMZ治療時，與對照組小鼠相比，生存率顯著下降.
TMZ治療顯著延長了sgCtrl轉(zhuǎn)導h543的小鼠移植后的存活時間，但未能延長表達SAR1A-MGMT重排的小鼠的存活時間(補充圖7h)。BLI分析證實TMZ對正常小鼠的抗腫瘤作用有限.
免疫組化顯示TMZ給藥后，BTRC-MGMT小鼠BrdU摻入增加，γH2AX積累減少.
評估MGMT融合是否可以在EXOs中檢測到。用標準的超離心法從含有SAR1A-MGMT和sgCtrl的條件培養(yǎng)基中純化了EXOs。蛋白質(zhì)含量的Western blot證實了外泌體特異性標記TSG101和Alix在外泌體中富集. MGMT在表達融合事件的細胞中的存在(圖4d)。
RT-PCR檢測到MGMT融合的mRNA在EXOs中(圖4e)。
原位注射U251 BTRC-MGMT細胞的小鼠血清中分離的外顯子是否也表現(xiàn)出融合轉(zhuǎn)錄。值得注意的是，RTPCR分析證實了btrc - mgmt衍生的循環(huán)血液外顯子中存在cDNA融合片段.