外泌體破壞皮膚的機(jī)制

Stevens-Johnson綜合征(SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(TEN)是危及生命的藥物不良反應(yīng)，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、嚴(yán)重紅斑、由角化細(xì)胞凋亡和壞死松解引起的大面積表皮損傷。SJS/TEN中角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡可能是由細(xì)胞毒性細(xì)胞或可溶性FasL、穿孔素或顆粒素引起的。然而，對(duì)SJS/TEN中表皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制了解甚少。

2020年12月17日，第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院在 Science 子刊 Science Translational Medicine 雜志在線發(fā)表題為Plasma exosomal miR-375-3p regulates mitochondria-dependent keratinocyte apoptosis by targeting XIAP in severe drug-induced skin reactions 的研究論文，報(bào)道了SJS/TEN患者血漿外泌體破壞皮膚的機(jī)制。

作者假設(shè)血漿來源的外泌體通過向皮膚傳遞miRNA信號(hào)誘導(dǎo)SJS/ TEN 患者的角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證我們的假設(shè)，我們從SJS/TEN患者的血漿中純化和表征了外泌體，并使用下一代測(cè)序來比較來自健康對(duì)照組和多形紅斑(EM)或SJS/TEN患者的血漿衍生外泌體的miRNA譜。我們發(fā)現(xiàn)，與其他組相比，miR-375-3p在TEN 個(gè)外泌體中顯著上調(diào)。我們進(jìn)一步研究了miR-375-3p的潛在靶點(diǎn)，并研究了其對(duì)人原代角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的影響。

技術(shù)路線：

一、血漿外泌體的表征

二、血漿來源的外泌體被人類原代角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)化并誘導(dǎo)促凋亡

Annexin V和TUNEL分析表明， TEN外泌體處理過的人類原代角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡顯著增加(圖2、C、D)。

Caspase-3 (CAS-3)活性在 TEN外泌體組中上調(diào)，但在對(duì)照組中未上調(diào)(圖2E)。

 TEN外泌體也上調(diào)cleaved caspase-3 (CAS-3)、cleaved caspase-9 (CAS-9)、BAX和凋亡蛋白酶激活因子1 (APAF-1)，但顯著下調(diào)BCL-2(圖2F).

附圖： TEN外泌體組中，分離細(xì)胞質(zhì)和線粒體部分，Western blotting結(jié)果表明從線粒體釋放的CYTO-C顯著減少，但細(xì)胞質(zhì)中的CYTO-C顯著增加。與EM或健康個(gè)體相比，SJS/ 10患者表皮中Cleaved CAS-3、CAS-9和BAX的活性更強(qiáng)。

總之，TEN外泌體被人類原代角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)化并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，在SJS/ TEN病灶中，焦亡、鐵死亡、壞死和自噬的標(biāo)記物顯著增加(圖。S4 S8)。

三、藥疹中血漿來源的外泌體miRNA表達(dá)譜

與EM和對(duì)照外泌體相比，Hsa-miR-375-3p、hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-582-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-194-5p、hsa-miR-215-5p和hsa-let-7f-5p是TEN中最豐富的miRNA類型。與其他組相比，miR-375-3p在TEN外泌體中顯著上調(diào)，比miR-200a-3p高10倍，比miR-122-5p高30倍(圖3D)。因此，后續(xù)的研究中使用了miR-375-3p。

四、miR-375-3p通過線粒體依賴途徑在體外促進(jìn)人原代角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染miR-375-3p可顯著上調(diào)CAS-3活性，降低角質(zhì)形成細(xì)胞活力，增加角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，而轉(zhuǎn)染miR-375-3p抑制劑則有相反的效果(圖4,C到E)。

角質(zhì)形成細(xì)胞中miR-375-3p過表達(dá)上調(diào)BAX、cleaved CAS-3、cleaved CAS-9和APAF-1;降低BCL-2;降低BCL-2/BAX比值(圖4F和S9A)。

原位雜交結(jié)果顯示，與TEM患者或健康個(gè)體相比，SJS/TEN 患者的表皮組織中miR-375-3p更為顯著(圖S10A)。miR-375-3p信號(hào)在SJS/TEN患者下/中表皮凋亡細(xì)胞中最為明顯，提示miR-375-3p可能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。線粒體缺陷與凋亡密切相關(guān)，BCL-2與BAX表達(dá)失衡可能與線粒體功能障礙相關(guān)(16)。TEM顯示SJS/TEN 患者線粒體腫脹、嵴缺失，而對(duì)照組線粒體顯示典型管狀模式(圖S10B)。

miR-375-3p過表達(dá)促進(jìn)了線粒體膜電位(MMP)崩潰，降低了三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生，這兩者都表明線粒體功能障礙(圖4,G和H)。

過表達(dá)miR-375-3p后，從線粒體到細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞色素易位增加，并被miR-375-3p抑制所阻斷(圖4I和圖S9B)。

這些數(shù)據(jù)表明，miR-375-3p通過線粒體依賴途徑促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。

五、XIAP是miR-375-3p在人原代角質(zhì)形成細(xì)胞中的直接靶點(diǎn)

應(yīng)用TargetScan、miRDB、miRWalk、miRTarBase和KEGG通路分析預(yù)測(cè)miR-375-3p的靶基因(圖5,A和B)。根據(jù)KEGG通路預(yù)測(cè)，miR-375-3p促進(jìn)凋亡的候選靶基因如下:真核翻譯起始因子2，亞單位α(EIF2S1/EIF2)，桿狀病毒凋亡抑制蛋白(IAP)重復(fù)包含3 (BIRC3)和x -連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)。EIF2S1 3’ UTR中的miR-375-3p結(jié)合位點(diǎn)在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中是保守的(圖S13A)，并且miR-375-3p mimics在野生型中降低了熒光素酶活性，而在突變型中卻沒有(圖S13B)。然而，SJS/ TEM患者中EIF2S1的表達(dá)增加，以及已知EIF2S1在促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡方面的積極作用，表明EIF2S1不可能是miR-375-3p的靶基因(圖S13C)。接下來，我們研究了BIRC3的表達(dá)，它也被稱為細(xì)胞凋亡抑制劑(cellular inhibitor of apoptosis, cIAP2)，是一種IAP。BIRC3在來自健康表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)，但在SJS/ 10表皮中僅微弱表達(dá)(圖S14A)。然而，無論是野生型還是突變型，miR-375-3p mimics都未能降低熒光素酶活性(圖S14, B和C)，這表明BIRC3不是miR-375-3p的靶標(biāo).XIAP作為miR-375-3p的中心靶點(diǎn)，以及SJS/TEN中角質(zhì)形成細(xì)胞死亡的潛在調(diào)控因子。

六、過表達(dá)miR-375-3p導(dǎo)致XIAP表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡

為了確定XIAP是否也促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，我們使用小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)敲低XIAP表達(dá)(圖6,A和B，以及圖S17A)，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞活力顯著降低圖6)。當(dāng)XIAP被下調(diào)時(shí)，CAS-3活性和凋亡率也升高(圖6、D和E)， APAF-1、BAX和BAK的豐度顯著升高(圖6F和圖S17、B和C)。

XIAP的下調(diào)促進(jìn)了MMP的破壞，降低了ATP的產(chǎn)生(圖6,G和H)。我們進(jìn)一步表明，XIAP下調(diào)后，BCL-2和MFN-2下調(diào)，而XIAP過表達(dá)則產(chǎn)生相反的作用(圖S18, A和B)。BCL-2和MFN-2的蛋白豐度比mRNA豐度受影響更顯著(圖S18C)。在用蛋白酶體抑制劑MG132處理后，即使在初級(jí)角質(zhì)形成細(xì)胞中XIAP被下調(diào)，BCL-2和MFN-2的表達(dá)也沒有改變，這表明XIAP在翻譯后水平上并沒有調(diào)控BCL-2和MFN-2(圖S19)。然后，我們探討了XIAP是否可以通過環(huán)己酰亞胺(CHX)阻斷蛋白合成來調(diào)節(jié)BCL-2和MFN-2的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，BCL-2的半衰期為6 ~ 9 h;然而，在過表達(dá)XIAP的組中，BCL-2的半衰期增加到9 ~ 12小時(shí)，表明XIAP誘導(dǎo)的BCL-2的穩(wěn)定性增強(qiáng)(圖1)。S20和S21)。在過表達(dá)XIAP的細(xì)胞中，MFN-2的半衰期由對(duì)照組的6 ~ 9小時(shí)延長(zhǎng)至9 ~ 12小時(shí)。同樣，XIAP敲除降低了MFN-2和BCL-2的穩(wěn)定性(圖。S20和S21)。鑒于XIAP可通過調(diào)節(jié)miRNA表達(dá)促進(jìn)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidergrowth factor receptor, EGFR)的翻譯(18)，XIAP可能通過間接機(jī)制在翻譯水平上調(diào)控BCL-2和MFN-2的穩(wěn)定性。

七．SJS/ TEN患者血漿外泌體中miR-375-3p的表達(dá)與臨床特征相關(guān)

在SJS/TEN患者中，外泌體miR-375-3p與葡萄糖呈弱正相關(guān)，而與c -肽和胰島素呈負(fù)相關(guān)(圖S28, D至F)。在高糖條件下胰腺是否會(huì)增加血漿外泌體miR-375-3p。我們比較了SJS/TEN患者在治療前和治療后的循環(huán)外泌體miR-375-3p，發(fā)現(xiàn)在發(fā)病后糖皮質(zhì)激素治療2周后miR-375-3p下降(52.5%)(圖S28G)。