CircRNA在腫瘤研究中的經(jīng)典實驗設(shè)計思路 EWSR1誘導(dǎo)的circNEIL3通過穩(wěn)定IGF2BP3促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展和外泌體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞免疫抑制極化

作者通過分析環(huán)狀RNA在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)譜，鑒定了一個來自NEIL3的環(huán)狀RNA, hsa_circ_0001460，命名為circNEIL3，在體外和體內(nèi)促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展。隨后通過不同的通路，闡明circNEIL3促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展的分子機制。該文章發(fā)表在《Molecular Cancer》，IF: 41.44。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. CircNEIL3在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào)

作者首先分析了39個膠質(zhì)瘤組織(11個GBM和28個低級別膠質(zhì)瘤(LGG))和8個正常腦組織(NBTs)中環(huán)狀RNA的表達(dá)譜?；鹕綀D顯示，在GBM和LGG之間，以及LGG和NBTs之間，circRNA表達(dá)有系統(tǒng)性差異(圖1A, B)，在膠質(zhì)瘤組織中差異上調(diào)的環(huán)狀RNA (Log2FC≥4, P adj≤0.05)，并鑒定出hsa_circ_0001460 (圖1C)。與NBTs相比，CircNEIL3在膠質(zhì)瘤組織中顯著上調(diào)，且隨著膠質(zhì)瘤分級的增加其表達(dá)增加(圖1D)。ROC曲線表示circNEIL3可預(yù)測膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后(圖1E)。通過UCSC基因組學(xué)研究所生物信息學(xué)網(wǎng)站，發(fā)現(xiàn)circNEIL3在NEIL3基因的第8外顯子和第9外顯子之間反接，長度為596 nt(圖1)。使用發(fā)散引物擴增circNEIL3的后剪接位點，并通過Sanger測序確認(rèn)(圖1F)。凝膠電泳分析結(jié)果顯示，circNEIL3只能從cDNA中擴增出來，而從cDNA和gDNA中可以擴增出線性形態(tài)(圖1G)。此外， RNase R和放線菌素D的處理證實了circNEIL3比NEIL3更穩(wěn)定(圖1H, I)。核質(zhì)分離實驗和FISH分析顯示，circNEIL3主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1J, K)。綜上所述，circNEIL3在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào)，且在GBM中表達(dá)最高，提示其參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展。

圖1 CircRNA在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)譜和circNEIL3的特征

2. CircNEIL3在體外和體內(nèi)均可促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生

功能實驗表明：下調(diào)circNEIL3顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，過表達(dá)circNEIL3顯著促進(jìn)這些細(xì)胞行為(圖2A-D)。體內(nèi)實驗顯示，circNEIL3下調(diào)可顯著抑制腫瘤生長和侵襲，延長荷瘤小鼠的生存時間，而circNEIL3過表達(dá)則會產(chǎn)生相反的效果(圖2E、F)。此外，切除的腫瘤切片免疫組化顯示，circNEIL3敲低的腫瘤組織中Ki67和CD44的表達(dá)低于載體組，而circNEIL3過表達(dá)則相反(圖2G)。綜上所述，circNEIL3在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和膠質(zhì)瘤進(jìn)展方面具有重要的功能。

圖2 CircNEIL3在體外和體內(nèi)促進(jìn)GBM細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

3. EWSR1促進(jìn)了circNEIL3在膠質(zhì)瘤中的生物發(fā)生

利用CircInteractome數(shù)據(jù)庫和starBase 3.0數(shù)據(jù)庫在circNEIL3的上下行區(qū)域預(yù)測了EWSR1的三個結(jié)合位點，分別稱為序列1、序列2和序列3(圖3A)。隨著膠質(zhì)瘤級別的升高，EWSR1表達(dá)水平升高，高表達(dá)的患者預(yù)后較差(圖3B)。此外，敲低EWSR1可以抑制GBM細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移(圖3C、D)。在circRNA轉(zhuǎn)錄組中，發(fā)現(xiàn)circNEIL3與EWSR1呈正相關(guān)(圖3E)，而在EWSR敲低的U251和A172細(xì)胞中，circNEIL3的表達(dá)明顯下降(圖3F)。將U251和A172細(xì)胞置于缺氧條件下0 h、6 h、12 h和24 h，隨著暴露時間的增加，EWSR1和circNEIL3的表達(dá)上調(diào)(圖3G，h)。通過RIP-qPCR檢測證實，EWSR1能與NEIL3 pre-mRNA序列1和序列3結(jié)合，且在缺氧條件下結(jié)合能力顯著上調(diào)（圖3I）。最后設(shè)計拯救實驗， EWSR1過表達(dá)誘導(dǎo)U251和A172細(xì)胞增殖、遷移和侵襲增加，可通過下調(diào)circNEIL3來逆轉(zhuǎn)（圖3J-L）。

圖3 EWSR1促進(jìn)circNEIL3的生物發(fā)生

4. CircNEIL3在物理上與IGF2BP3相互作用，并抑制泛素/蛋白酶體介導(dǎo)的IGF2BP3降解

為了探索circNEIL3誘導(dǎo)GBM細(xì)胞進(jìn)展的分子機制，首先進(jìn)行了RNA下拉分析和質(zhì)譜分析，以探索與circNEIL3結(jié)合的潛在蛋白。共鑒定出50個與circNEIL3相互作用的蛋白，其中不包括AGO2，排除了circNEIL3作為ceRNA的可能性。將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與CircInteractome數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的RBP進(jìn)行交叉。發(fā)現(xiàn)circNEIL3與IGF2BP3蛋白結(jié)合(圖4A)。RNA pull-down和RIP-qPCR進(jìn)一步證實了circNEIL3與IGF2BP3的相互作用(圖4B, C)。RNA fish -免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)circNEIL3與IGF2BP3在細(xì)胞質(zhì)中共定位(圖4D)。IGF2BP3由2個RNA識別基序(RMS)和4個KH結(jié)構(gòu)域組成。因此，建立了6個flag標(biāo)記的載體，并通過Western blot進(jìn)行了確認(rèn)，以測試哪個區(qū)域與circNEIL3相互作用(圖4E, F)。RIP-qPCR檢測顯示，circNEIL3主要結(jié)合在KH3-4區(qū)域，表明這個結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)招募circNEIL3(圖4G)。然后為了識別IGF2BP3結(jié)合的circNEIL3序列，設(shè)計了三個突變位點，最終觀察到IGF2BP3與circNEIL3的第三個位點結(jié)合(圖4H)。這些結(jié)果表明circNEIL3在細(xì)胞質(zhì)中與IGF2BP3發(fā)生相互作用。

然而，circNEIL3并沒有顯著改變IGF2BP3的mRNA水平(圖4I)，但顯著促進(jìn)IGF2BP3及其下游靶點CDK4/6、CD44和c-MYC的蛋白表達(dá)(圖4J)，表明circNEIL3可能通過破壞IGF2BP3蛋白的穩(wěn)定來調(diào)控膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。由于過表達(dá)circNEIL3可以提高IGF2BP3的蛋白表達(dá)水平，延長IGF2BP3的半衰期(圖4K)，表明circNEIL3通過蛋白酶體活性調(diào)控IGF2BP3蛋白的穩(wěn)定性。circNEIL3過表達(dá)降低了IGF2BP3的泛素化(圖4L)。然后，通過Ubibrowser數(shù)據(jù)庫鑒定出一個泛素化賴氨酸(K)殘基(K450)，位于IGF2BP3的KH3結(jié)構(gòu)域(圖4N)。利用Uniport數(shù)據(jù)庫預(yù)測了IGF2BP3的K450位點在6個物種中高度保守(圖4N)，并將K450泛素化位點可視化(圖4O)。然后，作者將預(yù)測位點從賴氨酸(K)突變?yōu)榫彼?R)，以確認(rèn)其作為泛素化靶點的作用。免疫沉淀(IP)結(jié)果顯示，與野生型IGF2BP3相比，K450突變顯著降低了IGF2BP3的泛素化水平，且在表達(dá)突變體的細(xì)胞中，cirNEIL3過表達(dá)導(dǎo)致的泛素化增強也被抑制(圖4M)，突顯出K450是IGF2BP3的主要泛素化位點。這些結(jié)果表明，circNEIL3通過抑制泛素/蛋白酶體依賴的降解，增強IGF2BP3蛋白的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。

圖4 CircNEIL3與IGF2BP3相互作用并抑制其泛素化

5. CircNEIL3通過抑制IGF2BP3蛋白HECTD4 -介導(dǎo)的泛素化

co-IP和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)屬于E3泛素連接酶的HECD家族的蛋白HECTD4可以與IGF2BP3結(jié)合。細(xì)胞實驗證明HECTD4可以抑制GBM細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移(圖5A, B)。免疫熒光實驗，證實IGF2BP3與細(xì)胞質(zhì)中的HECTD4共定位(圖5C)。此外，在HECTD4敲除GBM細(xì)胞中，IGF2BP3蛋白水平顯著升高(圖5D)，而其泛素化水平明顯降低(圖5E)，這表明在膠質(zhì)瘤中，HECTD4作為E3泛素連接酶通過泛素-蛋白酶體途徑降解IGF2BP3。

過表達(dá)circNEIL3可以阻斷IGF2BP3與HECTD4的結(jié)合(圖5F)，這解釋了circNEIL3是如何穩(wěn)定IGF2BP3的。Co-IP實驗觀察到HECTD4結(jié)合在IGF2BP3的KH3-4結(jié)構(gòu)域，這是circNEIL3與IGF2BP3相互作用的同一位點(圖5G和圖4G)。這些數(shù)據(jù)表明circNEIL3通過阻止HECTD4介導(dǎo)的泛素化而穩(wěn)定IGF2BP3蛋白。

圖5 CircNEIL3阻斷IGF2BP3與HECTD4的結(jié)合

6. CircNEIL3促進(jìn)膠質(zhì)瘤中巨噬細(xì)胞的浸潤

如圖6A所示，與circNEIL3低表達(dá)組相比，circNEIL3高表達(dá)組TME細(xì)胞浸潤更多，免疫評分和基質(zhì)評分更高，腫瘤純度更低。與circNEIL3低表達(dá)的膠質(zhì)瘤相比，circNEIL3高表達(dá)的膠質(zhì)瘤中巨噬細(xì)胞浸潤明顯增加。使用Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，過表達(dá)circNEIL3的GBM細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM)顯著促進(jìn)THP1分化的巨噬細(xì)胞遷移(圖6B)，而來自circNEIL3敲低的GBM細(xì)胞的CM則顯示相反的結(jié)果(圖6C)?？傊琧ircNEIL3過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞可以驅(qū)使巨噬細(xì)胞浸潤到膠質(zhì)瘤微環(huán)境。

GSEA結(jié)果表明，與circNEIL3低樣本相比，circNEIL3高樣本中YAP1信號基因標(biāo)記高度富集(圖6D)。對TCGA膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行IGF2BP3的檢測也得到了同樣的結(jié)果(圖6E)。qRT-PCR實驗驗證了circNEIL3促進(jìn)CCL2和LOX表達(dá)的結(jié)果(圖6F)，而這種由circNEIL3過表達(dá)誘導(dǎo)的表達(dá)增強可以通過IGF2BP3敲低來拯救(圖6G)。最后，circNEIL3可以增加GBM細(xì)胞中YAP1和LOX的蛋白表達(dá)(圖6H)。過表達(dá)circNEIL3引起的表達(dá)增加也可以通過敲低IGF2BP3來消除(圖6I)。總之，這些結(jié)果表明circneil3過表達(dá)的GBM細(xì)胞可能通過激活YAP1信號驅(qū)動巨噬細(xì)胞浸潤到腫瘤相關(guān)的微環(huán)境。

圖6 CircNEIL3促進(jìn)膠質(zhì)瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤

7. CircNEIL3可通過hnRNPA2B1被包裝成外泌體

circNEIL3下拉實驗的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)circNEIL3可以與hnRNPA2B1結(jié)合，hnRNPA2B1被報道可以運輸各種RNA進(jìn)入外泌體。并且在GBM細(xì)胞中通過RIP和RNA下拉實驗證實了circNEIL3和hnRNPA2B1之間的相互作用(圖7A, B)。在hnRNPA2B1敲低的GBM細(xì)胞中，circNEIL3在細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在外泌體中表達(dá)下調(diào)(圖7C)。綜上所述，這些結(jié)果表明，circNEIL3可以被hnRNPA2B1包裝成外泌體。

8. 外泌體向TAMs傳遞circNEIL3，從而使TAMs通過穩(wěn)定IGF2BP3獲得免疫抑制特性

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，circNEIL3過表達(dá)顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞激活標(biāo)志物CD163(圖7D)。隨著circNEIL3在外泌體中的表達(dá)增加，巨噬細(xì)胞激活標(biāo)志物、免疫抑制分子和SPP1（維持膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活并刺激血管生成）顯著上調(diào)(圖7E, F，圖S11J)?？傊?，這些結(jié)果表明，外泌體可以將circNEIL3傳遞給TAMs，從而使它們獲得血管生成和免疫抑制特性。為了闡明circNEIL3介導(dǎo)巨噬細(xì)胞免疫抑制特性的機制，通過RNA下拉和RIP實驗發(fā)現(xiàn)，在THP1分化的巨噬細(xì)胞中，circNEIL3與IGF2BP3結(jié)合的位點與腫瘤細(xì)胞相同(圖7G, H)。此外，在腫瘤細(xì)胞中觀察到，在THP1分化的巨噬細(xì)胞中，circNEIL3增加了IGF2BP3蛋白的表達(dá)，抑制了IGF2BP3的泛素化(圖7I, J)。因此，與GBM細(xì)胞一樣，IGF2BP3可以作為circNEIL3在巨噬細(xì)胞中的下游效應(yīng)因子，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向免疫抑制表型極化。western blot檢測結(jié)果證實，在THP1分化的巨噬細(xì)胞中，過表達(dá)circNEIL3和IGF2BP3均能提高YAP1蛋白的表達(dá)，而敲除它們的結(jié)果則相反(圖7K, L)。此外，敲除IGFB2P3可消除過表達(dá)circNEIL3對YAP1蛋白表達(dá)的增強(圖7M)，表明circNEIL3通過穩(wěn)定IGF2BP3蛋白來增強YAP1的表達(dá)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的免疫抑制表型極化。為了進(jìn)一步驗證circNEIL3在體內(nèi)對巨噬細(xì)胞免疫抑制極化的影響，將過表達(dá)cicrNEIL3的巨噬細(xì)胞或陰性對照載體與膠質(zhì)瘤細(xì)胞共原位植入裸鼠大腦。與NC組相比，circNEIL3過表達(dá)組腫瘤生長加快，荷瘤小鼠的生存時間延長(圖7N-P)。為了進(jìn)一步證明circNEIL3通過IGF2BP3-YAP1軸發(fā)揮作用，在臨床膠質(zhì)瘤患者局部組織中進(jìn)行了免疫熒光染色實驗。這些結(jié)果表明，IGF2BP3可以作為circNEIL3在巨噬細(xì)胞中的下游效應(yīng)因子，使巨噬細(xì)胞獲得免疫抑制特性，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。

圖7外泌體可將circNEIL3傳遞給TAMs，從而使其獲得血管生成和免疫抑制特性

結(jié)論：

作者發(fā)現(xiàn)了一種在人腦膠質(zhì)瘤組織中上調(diào)的新型環(huán)狀RNA circNEIL3。隨著膠質(zhì)瘤分級的增加，受EWSR1調(diào)控的circNEIL3表達(dá)增加。在功能上， circNEIL3在體外和體內(nèi)促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展。從機制上講，circNEIL3通過阻止HECTD4介導(dǎo)的泛素化來穩(wěn)定IGF2BP3，這是一種已知的致癌蛋白。此外，circNEIL3過表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞可驅(qū)動巨噬細(xì)胞浸潤至TME。最后，circNEIL3可通過hnRNPA2B1打包成外泌體，傳遞給浸潤的TAMs，從而使其通過穩(wěn)定IGF2BP3獲得免疫抑制特性，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展(圖7Q)。這些研究結(jié)果表明，circNEIL3可能是一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物和有希望的膠質(zhì)瘤治療靶點。