教你用7張圖發(fā)8分一區(qū)文章 RNA結(jié)合蛋白PCBP1通過穩(wěn)定DKK1 mRNA和隨后下調(diào)β-catenin抑制肺腺癌的進(jìn)展

近日，有研究通過發(fā)現(xiàn)polyc -RNA結(jié)合蛋白1 （PCBP1）作為腫瘤抑制因子和RNA調(diào)節(jié)因子，在人類癌癥中下調(diào)，從PCBP1出發(fā)揭示其在肺腺癌（LUAD）中的生物學(xué)功能。該研究發(fā)表在Journal of Translational Medicine》，IF：8.440。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. PCBP1低表達(dá)預(yù)示腫瘤患者預(yù)后不良

PCBP1多在不同水平上參與基因表達(dá)調(diào)控，其中一些成員在腫瘤發(fā)生中起著重要作用。hnRNP家族在腫瘤組織中顯著下調(diào)，而PCBP1在早期死亡組和長(zhǎng)期生存組中表達(dá)差異最顯著（圖1A）。K-M生存曲線顯示，在TCGA和GSE19188隊(duì)列中，PCBP1低表達(dá)組的總生存期均明顯較差（圖1B）。此外，PCBP1在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者對(duì)應(yīng)的IV期腫瘤組織中表達(dá)顯著降低（圖1C, D）。這些結(jié)果提示PCBP1在肺腫瘤發(fā)生中起重要作用。

接下來(lái)，分析PCBP1在LUAD中的表達(dá)及其對(duì)診斷的預(yù)測(cè)價(jià)值。免疫組化顯示PCBP1在肺腫瘤組織中表達(dá)下降（圖1E, F）。PCBP1與腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期顯著相關(guān)（圖1F）。作者比較了肺腺癌正常組織和腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)PCBP1 mRNA水平在腫瘤中較低（圖1G）。此外，PCBP1與三個(gè)病理參數(shù)在mRNA水平上有更顯著的相關(guān)性（圖1G）。PCBP1在蛋白和mRNA水平的低表達(dá)與LUAD患者的低生存率密切相關(guān)（圖1H, I）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明PCBP1是LUAD患者潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。

圖1 PCBP1的預(yù)后和潛在生物學(xué)價(jià)值的鑒定

2. PCBP1在體外可抑制LUAD細(xì)胞的增殖和遷移

接下來(lái)，探討PCBP1在LUAD進(jìn)展中的作用。采用集落形成和CCK-8實(shí)驗(yàn)評(píng)估PCBP1對(duì)細(xì)胞增殖的影響：PCBP1敲低顯著增加了A549和H358細(xì)胞的集落形成（圖2A, B）和細(xì)胞增殖。Sh-PCBP1細(xì)胞的細(xì)胞增殖率增加（圖2D，E），PCBP1過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖（圖2F）。創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組細(xì)胞相比，sh-PCBP1細(xì)胞具有更高的細(xì)胞遷移能力（圖2G、H），而這些指標(biāo)在過表達(dá)PCBP1的細(xì)胞中降低（圖2I）。綜上， PCBP1可以抑制肺腺癌的發(fā)展。

圖2 PCBP1對(duì)LUAD體外生物學(xué)行為的影響

3. PCBP1與肺腺癌患者的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)

為了了解PCBP1影響LUAD存活的分子基礎(chǔ)，在PCBP1缺失后對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行了RNA測(cè)序。與對(duì)照組相比，sh-PCBP1中有643個(gè)下調(diào)基因和490個(gè)上調(diào)基因（圖3A）。為了進(jìn)一步研究已鑒定的DEGs的特征，采用基因腫瘤學(xué)和KEGG通路富集方法對(duì)交叉的差異基因進(jìn)行分析。差異基因主要在與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物過程中富集：細(xì)胞粘附分子結(jié)合、上皮細(xì)胞遷移（圖3B）和Wnt信號(hào)通路（圖3D）。這些通路都與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)過程。EMT相關(guān)基因取自“hallmark_epithelial - epithelial - MESENCHYMAL_TRANSITION”基因列表，使用熱圖顯示（圖3C）。對(duì)差異基因的富集分析顯示，富集通路主要存在于轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路中，而在KEGG通路分析中，Wnt通路調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移。RNA-Seq分析顯示，在Wnt信號(hào)通路中，與對(duì)照組相比，PCBP1敲除細(xì)胞中有6個(gè)基因上調(diào)，10個(gè)基因下調(diào)（圖3E）。根據(jù)PCBP1的表達(dá)情況，將TCGA-LUAD患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。在GSEA結(jié)果中，PCBP1低表達(dá)組也富集了“上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化”通路（圖3F）。因此選擇了22個(gè)基于fold-change和功能的差異基因?qū)?/span>PCBP1敲低和過表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR以驗(yàn)證RNA測(cè)序結(jié)果（圖3G）。這些發(fā)現(xiàn)揭示了PCBP1與LUAD患者轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系。

圖3 PCBP1在轉(zhuǎn)移中的表達(dá)

4. PCBP1通過直接結(jié)合DKK1 mRNA抑制LUAD進(jìn)程，延長(zhǎng)其mRNA穩(wěn)定性

DKK1屬于與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的Wnt信號(hào)通路。基于以上結(jié)果， DKK1可能是影響PCBP1改變時(shí)腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素（圖4A）。結(jié)果表明，在A549和H358細(xì)胞中PCBP1敲低可降低DKK1蛋白水平，而在A549細(xì)胞中過表達(dá)PCBP1可提高DKK1 mRNA水平（圖4B）。在蛋白質(zhì)水平上也觀察到了同樣的結(jié)論（圖4C）。PCBP1已被確定為調(diào)節(jié)許多癌癥相關(guān)基因的選擇性剪接、翻譯和RNA穩(wěn)定性。為了確定PCBP1和DKK1之間的相互作用，進(jìn)行了RIP分析。RIP分析顯示，在A549細(xì)胞中，DKK1結(jié)合PCBP1（圖4D）。此外，利用A549細(xì)胞裂解液進(jìn)行RNA-pull down，然后進(jìn)行western blot分析和銀染（圖4E），驗(yàn)證了細(xì)胞中DKK1與PCBP1的結(jié)合。此外，又評(píng)估了DKK1 mRNA對(duì)放線菌素D治療的響應(yīng)穩(wěn)定性。PCBP1過表達(dá)導(dǎo)致DKK1 mRNA半衰期延長(zhǎng)（圖4F）。這些結(jié)果表明，PCBP1通過穩(wěn)定DKK1 mRNA密切調(diào)控DKK1的表達(dá)。

圖4 PCBP1介導(dǎo)DKK1 mRNA的穩(wěn)定性

5. PCBP1通過靶向DKK1抑制Wnt/β - catenin通路

DKK1是β - catenin依賴的Wnt信號(hào)通路的抑制劑。DKK1調(diào)控失調(diào)現(xiàn)已成為多種人類癌癥的重要因素。Western blot結(jié)果顯示，PCBP1敲除細(xì)胞中β-catenin表達(dá)上調(diào)，PCBP1過表達(dá)細(xì)胞中β-catenin表達(dá)下調(diào)。然而，phospho-β-catenin的表達(dá)則相反（圖5A）。此外，western blot檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物水平，表明PCBP1降低了Vimentin水平，而升高了claudin-1水平（圖5A）。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，sh-PCBP1細(xì)胞具有更高的細(xì)胞遷移能力（圖5B）。接下來(lái)，研究PCBP1是否通過調(diào)控DKK1在LUAD中抑制細(xì)胞遷移和遷移。RT-qPCR結(jié)果顯示，si-DKK1#1和si-DKK1#2敲除效率較好（圖5C）。PCBP1-OE轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，，phospho-β-catenin和claudin-1水平升高，β-catenin和vimentin水平降低，但si-DKK1逆轉(zhuǎn)了這些結(jié)果（圖5D）。此外，過表達(dá)PCBP1的A549細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力明顯下降，通過下調(diào)DKK1可以消除這種能力（圖5E）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明DKK1是PCBP1的重要下游靶點(diǎn)。

圖5 PCBP1/DKK1/β-catenin在LUAD細(xì)胞中調(diào)節(jié)遷移和EMT

6. PCBP1在體內(nèi)可抑制LUAD的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

采用小鼠尾靜脈注射PCBP1敲除細(xì)胞的方法，探討PCBP1在肺轉(zhuǎn)移中的作用。PCBP1基因敲除顯著降低了H358小鼠模型的體重，并加重了A549（圖6A-C）和H358（圖6D-F）小鼠模型的肺轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)。在皮下異種移植模型中，PCBP1基因敲除組的腫瘤體積似乎比對(duì)照組大（圖6G,H）。而PCBP1過表達(dá)組的腫瘤生長(zhǎng)被顯著抑制，腫瘤體積更小，重量更輕（圖6I）。此外，IHC分析顯示，轉(zhuǎn)染sh-PCBP1后腫瘤組織中ki67陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加。此外，測(cè)量BALB/c nu小鼠切除腫瘤的重量，發(fā)現(xiàn)PCBP1抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和重量（圖6J）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明PCBP1介導(dǎo)肺轉(zhuǎn)移和LUAD腫瘤生長(zhǎng)。

圖6 PCBP1在LUAD體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

7. 在LUAD患者中PCBP1與DKK1呈正相關(guān)

為了檢驗(yàn)這些發(fā)現(xiàn)的臨床相關(guān)性，使用免疫組化染色檢測(cè)了72名具有配對(duì)相鄰正常組織的LUAD患者的臨床注釋隊(duì)列中PCBP1、DKK1和β-catenin的表達(dá)。數(shù)據(jù)顯示，與配對(duì)正常肺組織相比，腫瘤組織中DKK1蛋白表達(dá)下降，β-catenin蛋白表達(dá)增強(qiáng)（圖7A, B）。在LUAD患者中，DKK1高表達(dá)與生存率的提高密切相關(guān)，而β-catenin高表達(dá)則預(yù)示預(yù)后不良（圖7C）。同時(shí)，IHC染色檢測(cè)到DKK1和β-catenin的表達(dá)與腫瘤的大小，N分期和腫瘤分期有關(guān)（圖7D）。PCBP1得分較高的組織DKK1表達(dá)增加，β-catenin降低。相反，PCBP1得分較低的組織表現(xiàn)出較低水平的DKK1表達(dá)和較高水平的β-catenin（圖7E）。這些結(jié)果表明，在LUAD中PCBP1和DKK1呈正相關(guān)（圖7F）。PCBP1和DKK1均與β-catenin呈負(fù)相關(guān)（圖7F）。同樣的結(jié)果在TCGA和GSE19188數(shù)據(jù)庫(kù)中得到驗(yàn)證（圖7G）。這些結(jié)果表明PCBP1與DKK1呈正相關(guān)，而PCBP1和DKK1與β-catenin呈負(fù)相關(guān)，而β-catenin是LUAD OS的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。

圖7 高水平的PCBP1和DKK1在LUAD中表達(dá)預(yù)示著良好的臨床結(jié)局

結(jié)論：

該數(shù)據(jù)揭示了PCBP1-DKK1-β-catenin在LUAD中的一種新的調(diào)控機(jī)制，并表明PCBP1可能作為一種與良好預(yù)后因素相關(guān)的新標(biāo)志物，強(qiáng)調(diào)了PCBP1作為一個(gè)有前途的治療靶點(diǎn)的潛力。