聽說過嗎？單細胞免疫譜——揭示免疫治療新機制
過敏性鼻炎已成為影響全球的問題。通常只有一種方法可以改善這種疾病，即抗體特異性免疫治療，然而這種治療的作用機制尚不清楚。本研究通過單細胞測序（scRNA-Seq）和單細胞保留庫測序分析（scVDJ-Seq）揭示了該作用的部分機制為：舌下免疫治療（SLIT）促進致病性Th2細胞上肌蛋白的表達并抑制Th2細胞功能。本研究于2022年6月發(fā)表在《Journal of Allergy And Clinical Immunology》IF:13.391期刊上。
技術路線
主要實驗結果：
1、CD4+記憶T細胞的功能亞群和克隆比例
從SLIP治療響應良好和較差的患者中獲得SLIT治療前1年和治療后1年的外周血單核細胞（PBMC）。在用柳杉抗原孵育和刺激后，分離CD3+CD4+ CD45RO+ T細胞用于scRNA-Seq分析和T細胞受體（TCR）的scVDJ-Seq分析。將所有高質(zhì)量細胞的TCR V(D)J數(shù)據(jù)合并，校正讀取深度和線粒體讀取計數(shù)，并進行PCA分析。根據(jù)已知轉(zhuǎn)錄因子和標記基因的表達水平，在PBMCs CD4+T記憶細胞中鑒定出7個T細胞簇（naive、Treg、Th2、T,h17、細胞毒性CD4、自然殺傷T和干擾素反應細胞）（圖1A），圖1B展示了7個亞群在不同樣本中的分布，圖1C展示了每個亞群的代表性基因表達（圖1C）。在這些細胞中，TCR在67.2%-78.5%的細胞中表達（圖1D），然而超過1個克隆的CD4+T記憶細胞在較差響應和良好響應的患者中分別占32.8%和21.5%，超過5個克隆的CD4+T記憶細胞在較差響應和良好響應的患者中分別占10.3%和4.7%。然后，比較T細胞克隆，這些簇的相對比例展示在UMAP中（圖1E）。隨著克隆數(shù)量的增加，克隆在效應細胞中積累。此外，結果顯示多克隆T細胞主要是Th2，Th17，Treg，細胞毒性CD4細胞，值得注意的是克隆群體中Th2細胞亞群最多（圖1F）。
圖1 scRNA-Seq和保留庫分析揭示T細胞亞群的變化
2、SLIT前和后的T細胞亞群變化
為了探究T細胞響應，比較了抗柳杉抗原SLIT處理前后的T細胞亞群。盡管存在較大的個體差異，但如果不按克隆數(shù)分類，對反應較差和反應較好的T細胞亞群，在SLIT前和SLIT后都看不到整體T細胞亞群的一致變化（圖2A-B）。因此，作者重新分析了這些細胞，將它們分為形成單個克隆的獨特細胞群和形成多個克隆的克隆群體。觀察到獨特細胞群和2-5克隆細胞群在SLIT前后沒有明顯變化，而>5的克隆細胞群顯示Th2和Treg細胞只在反應良好的患者中擴增（圖2C）。
接下來，作者比較了所有患者CDR3區(qū)TRA和TRB的氨基酸序列，以評估在SLIT前后TCR保留庫的改變對抗原特異性的影響。克隆頻率較高的前7個CDR區(qū)域的T細胞克隆在SLIT前后的重疊率為60% ~ 80%（圖3A）。此外，如果克隆數(shù)量限制在>5，在SLIT前和后的樣本中，TRA和TRB的CDR區(qū)域都有80%的重疊（圖3B）。
圖3 SLIT前和后的TCR保留庫變化
3、SLIT前和后的Th2細胞和Treg細胞的功能性調(diào)節(jié)
由于前問結果提示，SLIT可誘導Th2和Treg細胞克隆擴增，并具有相同的抗原特異性，因此作者對SLIT后出現(xiàn)克隆擴增的Th2和Treg細胞進行免疫譜分析，并進行PCA分析以提高分辨度并重新評估免疫譜（圖4A）。結果顯示，根據(jù)IL-5、IL-13、PTGDR2 (CRTH2)、KLRB1 (CD161)的表達，Th2細胞可分為2個簇：一個高功能的Tpath2細胞群和一個功能受損的Th2細胞群（Trans Th2）（圖4B）。接下來，進行軌跡分析，以確定這些細胞群的分化途徑，并根據(jù)基因表達譜的相似性評估假時間，發(fā)現(xiàn)Th2細胞中存在由Tpath2細胞向Trans Th2細胞分化的軌跡（圖4C），同時在Trans Th2細胞和Treg細胞群之間有連續(xù)的中間細胞，表明Trans Th2細胞向Treg細胞分化。此外，通過對這些SLIT前后的TCR克隆細胞群比較，發(fā)現(xiàn)對反應良好的多克隆細胞，尤其是>5克隆中，SLIT處理后，Treg細胞和Trans Th2細胞以及Tpath2細胞的克隆擴增減少（圖4D-4E）。這些結果暗示了Trans Th2細胞克隆轉(zhuǎn)分化為Treg細胞的可能性。
圖4 SLIT前和后的Th2細胞和Treg細胞的功能性調(diào)節(jié)
4、從Th2細胞到Treg細胞的遺傳漂移
接下來，全面比較了每個細胞群體的基因表達譜，以尋找促進Trans Th2細胞介導向Treg細胞分化和SLIT后免疫耐受的功能分子。結果發(fā)現(xiàn)，與Tpath2細胞相比，在Trans Th2細胞中，抑制Th2細胞轉(zhuǎn)錄程序的轉(zhuǎn)錄因子musculin（MSC）和T細胞遷移抑制受體LPAR6的表達高度上調(diào)（圖5A）。在Trans Th2細胞中，MSC在分化軌跡末端也有高特異性表達（圖5B）。Trans Th2細胞和Treg細胞的比較顯示，Treg細胞中FOXP3、抑制性細胞因子如TGF-β和IL-10RA以及抑制性免疫檢查點因子CTLA4的表達更高。關于每個 T 細胞亞群中 SLIT 后的變化，MSC 和 IL-2 表達在 Trans Th2 中SLIT后上調(diào)，而TGF-β 表達在 Trans Th2和Treg細胞中SLIT后都上調(diào)（圖5C）。
圖5 比較功能性Th2細胞，功能抑制Th2細胞，Treg細胞間的基因表達
5、生物標志物的潛力
鑒于MSC和IL-2表達的這些變化，以及它們在Trans Th2細胞中的強表達，作者從抑制Th2細胞功能的角度，在之前的柳杉抗原的SLIT臨床試驗樣本中，研究這些分子是否可以作為SLIT的生物標志物。為了評估它們作為生物標志物的實用性，通過PCR檢測了抗原刺激后整個PBMCs中MSC和IL-2的表達。與安慰劑組在SLIT后MSC沒有特別增加的樣本相比，活性藥物組在治療開始后1年MSC顯著增加（圖6B），IL-2表達在治療1年后也呈上升趨勢（圖6C）。此外，還分析了36例門診患者，以確定MSC是否可以作為SLIT療效的生物標志物。SLIT治療前和治療后1年培養(yǎng)的PBMCs中，反應良好的患者在SLIT后MSC表達明顯增加（圖7A）。然而，IL-2表達未見明顯變化（圖7B）。這些結果證明了評估 MSC在PBMC中的功效作為評估對SLIT的治愈反應的有用性。
圖6 2/3期臨床試驗標本中MSC和IL-2的分析
圖7 從反應好的和反應差的患者標本中分析MSC和IL-2的表達
總之，本文通過結合單細胞分析和保留庫分析描述了SLIT引起的癥狀減輕機制。 具體而言，促進 MSC 在 Tpath2 細胞中的表達可能通過抑制 Th2 細胞功能并允許它們分化成 Treg 細胞來促進 SLIT 誘導的癥狀減輕。目前正在設計各種過敏原特異性免疫療法。由于MSC表達可用作其功效的標志，開發(fā)有效產(chǎn)生 MSC 的方法可以提高這種療法的有效性。
參考文獻：
Iinuma Tomohisa., Kiuchi Masahiro., Hirahara Kiyoshi., Kurita Junya., Kokubo Kota., Yagyu Hiroyuki., Yoneda Riyo., Arai Tomoyuki., Sonobe Yuri., Fukuyo Masaki., Kaneda Atsushi., Yonekura Syuji., Nakayama Toshinori., Okamoto Yoshitaka., Hanazawa Toyoyuki.(2022). Single-cell immunoprofiling after immunotherapy for allergic rhinitis reveals functional suppression of pathogenic Th2 cells and clonal conversion. J Allergy Clin Immunol, undefined(undefined), undefined. doi:10.1016/j.jaci.2022.06.024