組織中細(xì)胞外囊泡的分離方法

細(xì)胞外囊泡(EVs)是一種異質(zhì)性的雙層膜納米粒子，在細(xì)胞間的信息傳遞中起著重要的作用。EVs可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、血管生成和細(xì)胞存活。此外，來自多種類型癌癥的EVs已被證明具有診斷和預(yù)后價值，這可能會改善未來的癌癥治療方案。根據(jù)其生物起源和大小的差異，EVs通常被分為兩個亞組，微泡和外泌體。微泡由質(zhì)膜上出芽形成，其直徑約為100-1000 nm。外泌體在多泡小體中產(chǎn)生，并通過胞吐途徑被釋放到細(xì)胞外部，其直徑約為30-200 nm。迄今為止，大多數(shù)的EVs研究都是在細(xì)胞系上進(jìn)行的，但對這些研究如何代表EVs在體內(nèi)的特征知之甚少。在此總結(jié)一種優(yōu)化后的從組織中分離EVs的方法。優(yōu)化主要是在黑色素瘤轉(zhuǎn)移組織上進(jìn)行的，但該方案已應(yīng)用于其他幾種類型的癌癥以及小鼠和人類的健康組織。詳細(xì)操作步驟如下(圖1)：

1. 收集樣品

收集組織后，將其保存在冰上的PBS中，然后立即進(jìn)行EV分離處理。

2. 分離組織

將組織輕輕地分解成小塊(約2×2×2 mm)。

3. 酶的孵化

將分解后的組織與膠原酶D和DNase I在37℃下孵育30 min，在旋轉(zhuǎn)攪拌機上以24 rpm/min的速度輕微攪拌，這一步驟使EVs從包裹它們的組織碎片中分離出來。

4. 過濾

采用70 μm孔徑過濾器，通過過濾步驟去除最大的元素。

5. 差速離心

剩余液體分別用300 g和2000 g差速離心10 min，以清除細(xì)胞和組織碎片。將上清液16,500 g離心20 min收集大型EVs(lEVs)的粗餾分，118,000 g離心2.5 h收集小型EVs(sEVs)的粗餾分。

6. 密度梯度

為了進(jìn)一步處理，lEVs和sEVs裝載在單個碘二甲醇密度梯度(OptiPrep)上。將粗制EVs溶解在60%(wt/vol)OptiPrep溶液中，然后在其上放置一個間斷的OptiPrep梯度溶液(35%、30%、28%、24%、22% × 2和20%(wt/vol))。186,000 g離心16 h后，共收集4個EVs亞種群。兩個EVs亞種群被命名為“大、小低密度(LD)EVs”，從20-22%(wt/vol)碘二醇層的界面收集(約1.111-1.121 g/cm3)，另外兩個亞種群稱為“大、小高密度(HD)EVs”，從30-35%(wt/vol)碘二醇層的界面收集(約1.163-1.189 g/cm3)。

圖1. 組織衍生EVs的分離程序示意圖概述