褪黑激素改善帕金森病

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2022-10-11
MLT通過抑制STAT相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎極化來改善神經(jīng)炎癥,為PD的神經(jīng)保護(hù)治療提供了替代方案。本文于......

帕金森病(PD)的一個(gè)重要病理生理成分是晝夜節(jié)律紊亂,與循環(huán)褪黑激素(MLT)水平下降密切相關(guān)。近年來有報(bào)道稱維甲酸相關(guān)孤核受體(RORα)是MLT潛在的內(nèi)源性配體,在多種疾病中發(fā)揮著重要作用。然而,RORα在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。在這里,我們通過一個(gè)細(xì)胞PD模型顯示,在MPP+處理的BV2細(xì)胞中,RORα表達(dá)下調(diào),而MLT處理后上調(diào)。在MPTP誘導(dǎo)的小鼠模型中,中腦組織中RORα水平降低,MLT處理顯著提高了RORα水平,保護(hù)了多巴胺神經(jīng)元。此外,siRNA介導(dǎo)的下調(diào)暗示了STAT通路的參與??傊?,MLT通過抑制STAT相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎極化來改善神經(jīng)炎癥,為PD的神經(jīng)保護(hù)治療提供了替代方案。本文于2022年7月發(fā)表于“NPJ Parkinson’s Disease”(IF=9.304)上。


技術(shù)路線



結(jié)果

1RORαMPP+處理的BV2細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)

為探討RORα是否參與PD的炎癥過程,我們首先研究了不同濃度(0-100 μM)MPP+BV2細(xì)胞的生物學(xué)作用。結(jié)果顯示50 μM MPP+誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞活力下降25-30%(補(bǔ)充圖,未展示)。RT-qPCRWB分析顯示,MPP+-處理的BV2細(xì)胞中,低劑量(1020 μM) MPP+處理后,RORα的表達(dá)增加,但在高劑量(50 μM)時(shí)顯著降低(1a-c)。我們還觀察到,隨著MPP+濃度的增加,促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)逐漸增加,而IL-10等抗炎因子逐漸減少(1d)。RORα表達(dá)的改變與細(xì)胞因子水平的改變提示RORαPD中具有抗炎癥作用。



2 MLT在體外增加RORα表達(dá),抑制促炎性M1樣小膠質(zhì)細(xì)胞極化,減少神經(jīng)炎癥

我們探索了MLTMPP+處理的BV2細(xì)胞的潛在抗炎機(jī)制。RT-qPCR和WB分析表明,MLT(50μM)完全逆轉(zhuǎn)了MPP+在50μM時(shí)誘導(dǎo)的RORα的降低,盡管最終水平低于單獨(dú)使用MLT(圖2a-c)。同時(shí),ELISA檢測到MLT處理后抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10水平升高,促炎細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)濃度顯著降低(圖2d),進(jìn)一步證實(shí)了MLT在MPP+處理的BV2細(xì)胞中的抗炎作用。此外,在PD的進(jìn)展過程中,小膠質(zhì)細(xì)胞極化在神經(jīng)炎癥發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。因此,我們進(jìn)一步分析了MLT對細(xì)胞模型中小膠質(zhì)細(xì)胞分化的影響。在應(yīng)用MPP+前半小時(shí)應(yīng)用MLT,并在藥物干預(yù)后24小時(shí)通過RT-qPCR測量極化標(biāo)志物。結(jié)果表明,MLT治療降低了促炎分子(如iNOS、CD36、IL-1β、TNF-α)以及DAM表型因子如TREM2和TLR4的基因表達(dá),但增加了抗炎M2樣標(biāo)記物CD206和ARG-1的表達(dá)(圖2e-g)。這些結(jié)果表明,RORα通過減少小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎性M1和DAM表型標(biāo)記物的表達(dá),在MLT的抗炎作用中發(fā)揮作用。



3MPTP處理的小鼠中RORα表達(dá)降低,且MLT顯示出減輕MPTP的抗炎作用

為了研究RORα與體內(nèi)PD之間的關(guān)系,我們使用MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型。與體外結(jié)果一致,MPTP處理的小鼠的中腦組織RORα水平下調(diào)(圖3a-c)。為了探討MLT在體內(nèi)是否具有相同的抗炎作用,在MPTP注射前半小時(shí)注射MLT。我們觀察到,與對照組相比,MLT治療組的小鼠在運(yùn)動(dòng)功能方面表現(xiàn)更好(未展示)。MLT治療后,炎癥因子(包括IL-6、IL-1β、TNF-α)的血清水平降低,而抗炎因子(如IL-4和IL-10)顯著增加(圖3d)。此外,免疫熒光顯示MLT處理可防止TH陽性細(xì)胞在SNc中丟失(圖3e,f)。這些結(jié)果表明,MLT對DA神經(jīng)元具有抗炎和保護(hù)作用,從而改善MPTP誘導(dǎo)的小鼠模型的運(yùn)動(dòng)癥狀。



4MLT增加MPTP處理小鼠的RORα水平,并降低促炎和DAM相關(guān)基因表達(dá)

我們觀察到,MLT治療顯著增加了中腦組織的RORα水平(圖4a-c)。RORα的免疫組織化學(xué)染色圖像顯示了類似的結(jié)果(圖4d,e),表明MLT的作用可能與RORα有關(guān)。此外,我們研究了MLT是否能改變MPTP誘導(dǎo)的小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞表型。MPTP和MLT+MPTP處理組的小膠質(zhì)細(xì)胞均因IBA-1的增加而激活。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn),促炎M1樣和DAM表型標(biāo)記物減少,而抗炎M2樣表型分子增加(圖3g-i)。類似地,MLT處理組中IBA1+iNOS+細(xì)胞的熒光強(qiáng)度小于MPTP組,而MLT+MPTP組中IBA1+ARG-1+細(xì)胞的熒光強(qiáng)度高于MPTP組(圖4f,g)??傊琈LT處理通過下調(diào)促炎和DAM相關(guān)分子改變了小膠質(zhì)細(xì)胞表型。



5RORα缺失促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞促炎表型極化,加重神經(jīng)炎癥

據(jù)報(bào)道,RORα可在多種疾病中發(fā)揮抗炎作用。為了驗(yàn)證RORα在MLT對MPP+處理的BV2細(xì)胞的影響中是否發(fā)揮了類似的作用,我們進(jìn)一步確定了RORα缺失對小膠質(zhì)細(xì)胞極化和炎癥的分子效應(yīng)。SiRNA用于敲除RORα。此外,在MPP+干預(yù)前,我們還使用了SR3335,一種合成的RORα選擇性逆激動(dòng)劑,和SR1078,一種合成的RORα激動(dòng)劑。在蛋白質(zhì)水平上,與MPP+處理組相比,MLT和SR1078處理組均顯示出抗炎作用。然而,SR3335并未增加MPP+處理細(xì)胞中TNF-α的水平或降低IL-10的水平。更重要的是,與MLT+MPP+的非沉默組相比,RORα敲除增加了培養(yǎng)基中促炎因子(TNF-α和IL-1β)的水平,并降低了抗炎因子(IL-10)(圖5a)。同時(shí),免疫熒光圖像顯示的iNOS的上調(diào)和ARG-1的下調(diào)也表明,BV2細(xì)胞中的RORα缺失可增強(qiáng)促炎極化(圖5b,c)。在mRNA水平上,RT-qPCR顯示出一致的結(jié)果,但MLT處理細(xì)胞組中ARG1表達(dá)除外。MLT+MPP+處理的細(xì)胞顯示免疫染色強(qiáng)度增加,但ARG-1的mRNA減少(圖5d)。這些結(jié)果表明RORα參與了MLT的抗炎作用。



6MLT通過STATRORα依賴的信號通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化

據(jù)報(bào)道,MLT的抗炎作用與STAT通路的激活有關(guān)。為了進(jìn)一步探索與MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和MLT介導(dǎo)的抗炎相關(guān)的信號通路,我們檢測了關(guān)鍵信號分子STAT的表達(dá)和磷酸化,尤其是STAT1和STAT3。結(jié)果表明,在MPP+刺激的BV2s中,p-STAT1的表達(dá)增加,而p-STAT3的表達(dá)顯著降低。MLT預(yù)處理抑制p-STAT1的表達(dá),但激活STAT3磷酸化。為了驗(yàn)證RORα是否參與MLT對STAT通路的影響,使用siRNA來敲除RORα。與沒有RORα-siRNA的細(xì)胞組相比,RORα的缺乏顯著降低了p-STAT3的水平,但增加了MLT預(yù)處理引起的STAT1的磷酸化(圖6a,b)。這些結(jié)果表明MLT通過RORα-STATs途徑介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的表型變化。


 

結(jié)論:本研究證明MLT通過改變小膠質(zhì)細(xì)胞的表型標(biāo)志物減輕神經(jīng)炎癥。MLT調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎表型轉(zhuǎn)變,且RORα在小膠質(zhì)細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。該發(fā)現(xiàn)指出了MLT-RORα軸的有益作用,其可減少炎癥反應(yīng)并改善PD。


參考文獻(xiàn):

Li J, Liu H, Wang X, Xia Y, Huang J, Wang T, Lin Z, Xiong N. Melatonin ameliorates Parkinson's disease via regulating microglia polarization in a RORα-dependent pathway. NPJ Parkinsons Dis. 2022 Jul 8;8(1):90. doi: 10.1038/s41531-022-00352-5.