通過單細胞RNA和ATAC測序揭示靈長類中間神經(jīng)元發(fā)育過程中進化保守和非保守的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

靈長類動物和嚙齒類動物大腦在大小和功能上的差異，以及興奮/抑制平衡紊亂與許多神經(jīng)發(fā)育障礙之間的關(guān)系，凸顯了研究靈長類神經(jīng)元嵴(ganglionic eminences, GEs)發(fā)育的重要性。單細胞RNA-seq (Single cell RNA-seq, scRNA-seq)已應(yīng)用于發(fā)育神經(jīng)科學(xué)的研究。傳統(tǒng)的批量RNA-seq產(chǎn)生組織的混合表達數(shù)據(jù)，與此相比，scRNA-seq可以提供單細胞的轉(zhuǎn)錄譜具有如此高分辨率的技術(shù)可以區(qū)分不同的細胞類型，并促進對復(fù)雜神經(jīng)系統(tǒng)的研究在小鼠中進行的單細胞研究揭示了胚胎發(fā)育過程中GE中間神經(jīng)元的分子和轉(zhuǎn)錄特征的多樣性。然而，關(guān)于靈長類GE發(fā)育過程中抑制性神經(jīng)元產(chǎn)生的研究報道很少，而且由于缺乏轉(zhuǎn)錄分析或轉(zhuǎn)錄分析的質(zhì)量，嚙齒類和靈長類之間的保守性和異質(zhì)性仍然有限此外，在復(fù)雜的細胞增殖，空間區(qū)分，譜系決定和中間神經(jīng)元遷移的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍然不清楚。該研究發(fā)表于《Cell Research》，IF:46.297。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 靈長類胚胎發(fā)育早期階段的細胞多樣性

作者對三個食蟹猴和兩個人類胎兒的胚胎進行了基于微滴的單鏈RNA測序，以解剖和比較靈長類胚胎的發(fā)育特征。獼猴的樣本來自胃周7、10和12，此時GEs仍處于早期發(fā)育階段。人類樣本來自孕9和13周，可能處于類似的發(fā)育窗口期(圖1a)。經(jīng)過測序、圖譜繪制和質(zhì)量控制，作者獲得了來自人類的13,782個細胞和來自獼猴的29,269個細胞。然后通過Seurat3.0.45將兩個物種的數(shù)據(jù)進行整合，使用Unsupervised方法將不同的細胞聚類(圖1b)，作者檢測到21個細胞簇。每個簇都用那些細胞分類的知名標記進行注釋(圖1b)。作者從表達NRN1和SLA46,47的相鄰大腦皮層中移除了兩個興奮性神經(jīng)元簇。作者還發(fā)現(xiàn)了由其相應(yīng)標記CX3CR1和SLC4A148,49識別的小膠質(zhì)細胞和血細胞簇，這些細胞簇也被移除。在剩余的GE來源細胞中，作者可以通過差異基因表達分析區(qū)分細胞與GE祖細胞和有絲分裂后細胞。神經(jīng)祖細胞包括放射狀膠質(zhì)細胞(radial glia cells, RGCs)和中間祖細胞(intermediate progenitor, IPCs)在GEs中高表達NES, VIM或ASCL1, DLL150(圖1c, d)。細胞周期中的增殖細胞可以用TOP2A51標記(圖1c, d)，有絲分裂后細胞可以進一步用區(qū)域特異性標記(圖1c)。MGE由特異性表達NKX2-1和LHX6的細胞組成，而LGE由MEIS2和ISLR2組成，CGE由NR2F1和NR2F2組成(圖1d)。然后作者計算了每一種細胞類型中人和獼猴細胞的歸一化細胞比例，并在河流圖中可視化，表明人和獼猴GE細胞分區(qū)之間沒有顯著差異(圖1e)?；谌祟惡瞳J猴不同細胞類型之間基因表達的相似性分析也證明了兩種物種數(shù)據(jù)整合的準確性(圖1f)。為了展示靈長類GEs的細胞發(fā)育軌跡，作者進行了RNA速度分析(scVelo) 52,53，這是一種通過重建轉(zhuǎn)錄變化的發(fā)育序列來推斷軌跡的方法。正如預(yù)測的那樣，來自GE祖細胞的細胞增殖并產(chǎn)生IPCs 54，然后在MGE、LGE和CGE中分化為各種譜系(圖1g)。綜上所述，作者的分析證實了獼猴和人類之間基本的進化保守性，揭示了人類和獼猴GEs細胞的多樣性和發(fā)展軌跡。

圖1 胚胎靈長類GEs的轉(zhuǎn)錄譜

2. 靈長類GE祖細胞的特異性細胞特性

在哺乳動物發(fā)育中的大腦中，神經(jīng)元是由大腦皮質(zhì)和GE中位于腦室區(qū)(VZ)的RGCs和位于腦室下區(qū)(SVZ)的IPCs產(chǎn)生55,56。作者將來自人類和恒河猴GE的神經(jīng)祖細胞分為亞群，包括RGCs和IPCs(圖2a)。通過HES1、VIM和NES的高表達來區(qū)分RGCs，而通過ASCL1、HES6和dlx250,57的表達來區(qū)分IPC(圖2b)。在所有的RGCs中，作者觀察了不同GE祖細胞的區(qū)域一致性。NKX2-1, PAX6和NR2F2的表達分別代表MGE, LGE和CGE祖細胞(圖2c)。

對大腦皮質(zhì)的研究表明，在靈長類新皮質(zhì)中，SVZ/VZ外有一個特殊的增殖區(qū)域，稱為室管膜下區(qū)(outer subventricular zone, oSVZ) 56位于oSVZ的外放射狀膠質(zhì)細胞(oRGs)不同于位于VZ的RGCs，它們被認為是靈長類動物，尤其是人類腦容量擴張的主要貢獻者值得注意的是，作者根據(jù)FAM107A、HOPX和TNC58的集中和特異性表達，在GEs的RGCs中識別出了靈長類動物特異性的外放射狀膠質(zhì)細胞(oRGs)(圖2a, b)。作者對HOPX進行了免疫染色，并證實了HOPX在GW13人類和GW12獼猴LGE的VZ和SVZ以及遠離VZ的區(qū)域的表達，與皮質(zhì)中的表達相似(圖2d)。然而，作者在小鼠GE或皮質(zhì)中未觀察到任何陽性信號。這表明在靈長類動物大腦發(fā)育過程中，oRGs不僅存在于大腦皮層，也存在于大腦GEs中。

然后，作者試圖發(fā)現(xiàn)靈長類動物和小鼠之間的GE祖細胞的差異。作者將靈長類動物的數(shù)據(jù)與已發(fā)表的小鼠GE數(shù)據(jù)集集成，并對祖先集群進行子集。針對HES1+ RGCs，作者進行了不同物種之間的差異基因表達分析(圖2e)。作者確定了一組在人類和獼猴中高度表達的基因(圖2e)。在這些差異表達基因(DEGs)中，有一些是之前報道的在人類RGCs中特異性表達的基因，如MOXD1和TCIM58-60(圖2e和補充信息圖S2c)，這驗證了作者的發(fā)現(xiàn)。其他增殖相關(guān)基因如CLU61和VEPH1,62也可能導(dǎo)致物種差異(圖2e)。

RGCs到IPCs以及有絲分裂細胞到有絲分裂后細胞的轉(zhuǎn)變在腦發(fā)育過程中細胞的發(fā)育和分化中起著重要作用。IPCs分析顯示，在靈長類和小鼠中，G蛋白耦聯(lián)受體信號級聯(lián)的調(diào)節(jié)因子RGS16在剛剛進入有絲分裂后期的細胞中特異性表達(圖2f)。通過scATAC-seq進行的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示，RGS16受幾個增殖相關(guān)基因的調(diào)控，如PAX6、GLI3和HES565-67(圖2f)。此外，區(qū)域特異性標記物，如MGE中的NKX2-1, CGE中的NR2F2和LGE中的ISL1開始表達與RGS16表達減少相關(guān)。這些模式表明RGS16可能作為IPCs和細胞命運決定的前體細胞之間的過渡因子。

以上結(jié)果表明，oRGs存在于靈長類發(fā)育中的大腦和大腦皮層中，這可能是靈長類和嚙齒類動物物種差異的原因之一。

圖2 靈長類GE祖細胞的特征和人類與小鼠的比較

3. MGE和CGE中細胞命運的決定

為了描繪MGE中的發(fā)育譜系，作者選取了LHX6表達組進行進一步的差異基因表達分析和軌跡重建(圖3a)。作者檢測到四種不同的細胞類型，其中一種根據(jù)它們的基因表達譜推測是前體。其他三個分支分別由表達SST、LHX8和CRABP1的細胞組成(圖3b, c)。

MGE前體由轉(zhuǎn)錄因子NKX2-1、TOX3和PLS3的表達確定(圖3b)，這些轉(zhuǎn)錄因子在細胞成熟過程中逐漸表達。所有在MGE中推測的更成熟的細胞都表達NRXN1和CHL1，根據(jù)生物過程基因本體，它們的功能與細胞黏附和軸突投射相關(guān)(圖3d)。

在整個SST+中間神經(jīng)元譜系中，ZEB2和PLS3與ERBB4和CXCR4等基因一起表達(圖3b)。已有研究報道ERBB4和CXCR4調(diào)控小鼠GE中間神經(jīng)元向大腦皮層的切向遷移。這些模式提示，來源于MGE的SST+中間神經(jīng)元會遷移到大腦皮層。

LHX8+細胞是MGE衍生的膽堿能投射神經(jīng)元，定位于基底端腦。大部分LHX8+細胞在人類GW9和獼猴GW7的MGE中被檢測到，但在三個較老的樣本中幾乎沒有檢測到(圖3f)。同樣，在小鼠MGE中，E11和14時檢測到的LHX8+細胞比E17時多得多。這表明LHX8+膽堿能投射神經(jīng)元可能在靈長類動物大腦發(fā)育的早期產(chǎn)生，這與小鼠的發(fā)現(xiàn)一致。

作者還發(fā)現(xiàn)了一小群與LHX8+細胞一起特異性表達CRABP1和ANGPT2的細胞(圖3b-e)。作者對這兩組細胞進行了獨立分析，以便找到更多關(guān)于它們的細節(jié)。特征圖顯示ANGPT2的表達與LHX8完全分離，而CRABP1在一小部分LHX8+細胞中表達(圖3e)。

對DEGs的進一步檢查發(fā)現(xiàn)，ANGPT2+組中有ST18和ETV1表達。ST18和ETV1被描述為皮質(zhì)小白蛋白(PV)中間神經(jīng)元前體的標志物17作者假設(shè)這些細胞會在大腦發(fā)育過程中遷移到大腦皮質(zhì)，并代表皮質(zhì)PV中間神經(jīng)元的前體。

以上結(jié)果表明，MGE中細胞分化較早，細胞譜系呈時間依賴性多樣化，Monocle370構(gòu)建的偽時間分析也體現(xiàn)了這一點(Fig. 3g, h)。

CGE主要產(chǎn)生5HT3aR+皮質(zhì)中間神經(jīng)元。作者提取了CGE細胞，以檢查其細胞多樣性。幾乎所有的CGE細胞都高表達NR2F1和NR2F2。在這一發(fā)育階段，作者檢測了CALB2和CCK的表達，它們可能代表了成人大腦皮質(zhì)中的一組雙極和多極中間神經(jīng)元。然而，在作者的數(shù)據(jù)中，其他經(jīng)典的CGE衍生的中間神經(jīng)元標志物(如RELN和VIP)幾乎不表達。這些結(jié)果表明，在靈長類CGE中，CCK+和CALB2+的中間神經(jīng)元可能比RELN+和VIP+的中間神經(jīng)元更早被指定。

圖3 靈長類動物MGE發(fā)育分析

4. 細胞命運決定著LGE的發(fā)展

LGE被認為是紋狀體MSNs和嗅球中間神經(jīng)元的起源。為了揭示其發(fā)育軌跡，作者從靈長類動物的合并數(shù)據(jù)中選擇了LGE譜系。在無監(jiān)督聚類后，在靈長類動物發(fā)育中的LGE中檢測到7種不同的細胞類型(圖4a)。作者發(fā)現(xiàn)，紋狀體MSN前體可以根據(jù)FOXP1的表達分為背側(cè)LGE (dLGE)和腹側(cè)LGE (vLGE)。在dLGE中，大多數(shù)細胞是TSHZ1+紋狀體黑質(zhì)(D1) MSN。在vLGE中，有兩種類型的中間神經(jīng)元，紋狀體黑質(zhì)(D1) MSNs表達PDYN，紋狀體蒼白球(D2) MSNs表達PENK74-76(圖4 b)。

然后作者進行了OB譜系和其他三個紋狀體譜系之間的差異基因表達分析?；鹕綀D顯示，OB譜系細胞高水平表達干細胞相關(guān)基因，如TOX3、CHD7和ID277-79(圖4c)。對這些DEGs的基因本體分析支持嗅球中間神經(jīng)元前體細胞存在于LGE的證據(jù)(圖4d)。不同時間的細胞分布表明，在人類和獼猴中，大多數(shù)OB譜系細胞都是在GE的后期階段檢測到的。這些結(jié)果表明，嗅球中間神經(jīng)元前體細胞在LGE中產(chǎn)生的時間晚于紋狀體MSN前體細胞，然后會遷移到嗅球進一步增殖。

有趣的是，作者還發(fā)現(xiàn)一組細胞共享一些不同于紋狀體MSNs的MGE標記，如LHX8, NKX2-1和LHX6，以及包括ZFHX3和ISLR280的LGE標記(圖4e)。這些細胞中MEIS2的表達缺失進一步表明它們與LGE來源的細胞不同。為了弄清楚這些細胞的身份和來源，作者發(fā)現(xiàn)它們的特異性標記在其他典型的LGE或MGE簇中不表達(圖4e)。NRP1編碼Semaphorin信號通路中的受體Neuropilin-1。81、82個NRP1在這些細胞中集中表達，而SEMA3A主要在共表達EBF1的典型LGE MSNs中表達(圖4e)。因此，作者假設(shè)這組細胞可能來源于MGE，并在SEMA3信號通路的調(diào)控下沿著發(fā)育中的紋狀體遷移到皮質(zhì)CellChat分析83(這是一種可以通過預(yù)測主要信號輸入和輸出來計算集群間細胞-細胞信號通路的工具)表明，SEMA3信號通路在LGE組中高度激活。在該通路中，SEMA3A表達細胞可能會釋放信號，并且NRP1表達細胞會對SEMA3A產(chǎn)生反應(yīng)(圖4f)。另一個在這些細胞中高表達的基因，PEG10，引起了作者的注意。PEG10可以產(chǎn)生長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA, lncRNA)和PEG10蛋白，兩者都可以促進癌細胞的遷移。之前的研究表明，MIR7-3HG作為競爭性內(nèi)源RNA從microRNA27 - a -3p釋放PEG10 RNA 86MIR7-3HG在來自人類樣本的這些細胞中也高水平表達，這可能調(diào)節(jié)PEG10的表達。此外，作者下載了Sun 's group80提供的原位測序數(shù)據(jù)，并將信號轉(zhuǎn)換為圖像。在人GW12時，一組NKX2-1+和LHX8+細胞位于遠離MGE的位置。這些結(jié)果表明，一組來自MGE的LHX8+中間神經(jīng)元會沿著LGE遷移，并在GE發(fā)育過程中受到SEMA3A-NRP1信號通路和MIR7-3HG-PEG10通路的調(diào)節(jié)(圖4g)。結(jié)合偽時間分析，作者對LGE的研究揭示了區(qū)域遺傳調(diào)控模型(圖4h)。

圖4 LGE發(fā)育和可能遷移細胞的特征

5. 人類基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

作者還對GW9的人類GE進行了scATAC-seq分析，以更詳細地研究人類發(fā)育中的GE的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。利用對scATAC-seq數(shù)據(jù)的兩次技術(shù)重復(fù)進行的單細胞分析，作者獲得了240,672個可訪問峰的一致集，這些峰代表潛在的順式調(diào)節(jié)元件。作者通過ArchR87整合了人類scATAC-seq數(shù)據(jù)和作者的GW9 scRNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)之間有4種主要的細胞類型匹配(圖5a)。作者使用基因評分，這是一種基于調(diào)控元件可及性的基因表達預(yù)測工具，在UMAP圖上將GE祖細胞、MGE、LGE和CGE的典型標記基因表達水平可視化(圖5b)。作者基于人類scRNAseq數(shù)據(jù)建立了四種主要細胞類型的標記基因列表。在標記列表中，ZNF503和LHX8是LGE和MGE譜系的代表性標記。作者在LGE中發(fā)現(xiàn)了ZNF503上游的兩個特異性可及基因組區(qū)域(開放染色質(zhì)峰)，在MGE中發(fā)現(xiàn)了LHX8上游的一個獨特的峰(圖5c)。根據(jù)UCSC瀏覽器中的UCSF腦甲基化數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu)， LHX8的這個獨特的峰包含一個高H3K4Me3修飾區(qū)域，以及一個預(yù)測的PRX2結(jié)合位點。與ZNF503相關(guān)的兩個峰均包含預(yù)測的MEIS1靶motif, MEIS1是LGE80的標記物。這些結(jié)果提示了LHX8在MGE中的表達和ZNF503在LGE中的表達的潛在調(diào)控機制。

然后，作者使用Tu實驗室開發(fā)的方法將遠端順式調(diào)控元件連接到單個基因，從而生成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GRN)，以識別候選轉(zhuǎn)錄因子(TFs)和調(diào)控因子。在捕獲的所有調(diào)控對中，作者選擇了那些都在Cytoscape88顯示的標記列表中的上游tf和下游基因(圖5d)。每一組細胞都顯示出其特定的和共享的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。例如，除了眾所周知的轉(zhuǎn)錄因子NKX2-1和LHX6, MGE還與CGE共享ARX和MEF2C，而NR2F2和NFIB則專門調(diào)控CGE的發(fā)育。LGE似乎有一個相對獨立的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，主要由ISL1、FOXP1和ZFHX4組成(圖5d)。作者基于蛋白-蛋白相互作用(PPI)從三個GE亞區(qū)中提取hub基因，得到了類似的結(jié)果(圖5e)。

接下來，作者試圖尋找可能在GE發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的未知基因。microRNA9-1的宿主基因MIR9-1HG(又名C1orf61)在作者的研究中脫穎而出。它參與了祖細胞和MGE的發(fā)育(圖5d)。作者通過尋找MIR9-1HG的潛在上游基因，以了解其調(diào)控機制。結(jié)合MIR9-1HG周圍開放的染色質(zhì)峰和TFs的潛在結(jié)合基序，作者從8個候選TFs中選擇了3個TFs, MAZ, TCF4和ASCL1(圖5f)。有報道稱MAZ是一種轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合蛋白89，這表明MAZ支持MIR9-1HG的表達。TCF4是一個參與神經(jīng)分化起始的TF 90,91，其結(jié)合基序被映射到MIR9-1HG轉(zhuǎn)錄起始位點周圍的開放染色質(zhì)峰(圖5)。不同細胞類型的基因表達水平之間的相關(guān)性分析顯示，在作者的數(shù)據(jù)中，在所有類型的細胞中，TCF4和MIR9-1HG之間均呈顯著正相關(guān)(圖5g)。這表明MIR9-1HG的表達受到TCF4的正調(diào)控。接下來，作者發(fā)現(xiàn)ASCL1結(jié)合基序位于MIR9-1HG下游的開放染色質(zhì)峰，尤其是在祖細胞簇中(圖5h)。在前體細胞中，ASCL1與MIR9-1HG呈顯著負相關(guān)，而在MGE和LGE中，ASCL1與MIR9-1HG呈正相關(guān)(圖5g)。作者假設(shè)ASCL1可能抑制MIR9-1HG在祖細胞中的表達，而不是在MGE中。作者進一步檢測了MIR9-1HG潛在的下游基因。由于MIR9-1HG是一個lncRNA, microRNA9-1可以從其剪接或生成，作者在三個不同的數(shù)據(jù)庫中搜索hsa-mir-9-1的靶基因，TargetScanVert, miRDB和TargetMiner。在所有數(shù)據(jù)庫中，共有4個基因同時受到hsa-mir-9-1-3p和5p的調(diào)控。其中兩個先前被描述為LGE特異性tf, ZFHX4和ID4。這兩個基因的表達水平在MGE和LGE中均與MIR9-1HG呈顯著負相關(guān)(圖5g)。在MGE中，MIR9-1HG高表達，而ZFHX4和ID4幾乎不表達，而在LGE中基因表達模式相反。綜上所述，這些結(jié)果提出了一個新的MIR9-1HG受ASCL1和TCF4調(diào)控的調(diào)控通路。mir-9- 1hg編碼的hsa-mir-9-1可抑制ZFHX4和ID4的表達。這可能解釋了在人類早期大腦發(fā)育過程中，MGE和LGE的不同命運是如何決定的。

圖5 MGE和LGE的scATAC-seq分析和調(diào)控異質(zhì)性

結(jié)論：

該研究證明了人類和食蟹猴在GEs中細胞多樣性和譜系特征的高度保守。研究者發(fā)現(xiàn)了人類和小鼠GE祖細胞之間的一些DEGs，并發(fā)現(xiàn)了靈長類GE中存在的oRGs。此外，該研究驗證了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在發(fā)育中的靈長類GE中的保守性，并探索了涉及不同GE區(qū)域的細胞遷移和命運決定的新機制。

參考文獻：

Zhao, Z., Zhang, D., Yang, F. et al. Evolutionarily conservative and non-conservative regulatory networks during primate interneuron development revealed by single-cell RNA and ATAC sequencing. Cell Res 32, 425–436 (2022). https://doi.org/10.1038/s41422-022-00635-9