增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變：僅僅分析了GEO中的兩個(gè)數(shù)據(jù)集就發(fā)了6分文章！

為探索增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（PDR）進(jìn)程中的相關(guān)免疫機(jī)制，作者通過分析GEO中兩個(gè)數(shù)據(jù)集（GSE60436和GSE102485），發(fā)現(xiàn)PDR和正常視網(wǎng)膜的纖維血管膜（FVM）中免疫細(xì)胞浸潤存在顯著差異。FVM中濾泡性輔助T細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞的比例顯著增加。此外，作者還發(fā)現(xiàn)了五個(gè)與M2巨噬細(xì)胞相關(guān)的基因，分別是COL5A2, CALD1, COL6A3, CORO1C和CALU。這些基因在PDR中高表達(dá)且可作為PDR的潛在標(biāo)記物。本文于2022年5月發(fā)表在《Front Endocrinol (Lausanne) 》，IF=6.06。

技術(shù)路線圖

主要結(jié)果

1）研究設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理

如圖1所示，差異基因分析和共表達(dá)分析的綜合分析結(jié)果表明免疫細(xì)胞（特別是M2型巨噬細(xì)胞）在DR進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步，F(xiàn)VM中的COL5A2, CALD1, COL6A3, CORO1C, and CALU可能是PDR的潛在M2巨噬細(xì)胞相關(guān)的生物標(biāo)志物。本研究選取的GSE60436數(shù)據(jù)集基于GPL6884（Illumina Humanwg-6 v3.0表達(dá)微珠芯片）的平臺(tái)，其中包括3個(gè)正常的視網(wǎng)膜組織和6個(gè)FVM組織。本研究的第二個(gè)數(shù)據(jù)集GPL18573基于GPL18573平臺(tái)（Illumina NextSeq 500），包含20個(gè)FVM（17例來自于2型糖尿病和3例來自于1型糖尿病患者），3個(gè)正常視網(wǎng)膜樣品和其他7個(gè)樣品。如圖2A所示，結(jié)果內(nèi)部校正和歸一化后，消除了2個(gè)不同數(shù)據(jù)集之間的批次效應(yīng)。最終，作者從兩個(gè)數(shù)據(jù)集中選擇了32個(gè)合格的樣品（6個(gè)正常視網(wǎng)膜和26個(gè)FVM）和14,132個(gè)交集基因進(jìn)行后續(xù)分析（圖2B）。接下來，在對兩組之間的生物學(xué)差異的主要分析中，GSEA表明免疫功能的多個(gè)標(biāo)志與FVM呈正相關(guān)，包括IL2-STAT5、IL6-JAK-STAT3信號(hào)通路、IFN-α、IFN-γ以及通過NF-κB傳導(dǎo)的TNF-α通路。其他高度富集的標(biāo)志包括血管生成，凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變等（圖2C）。這些結(jié)果初步表明了PDR中免疫活性與FVM之間的相關(guān)性。

圖1. 流程圖展示本研究的設(shè)計(jì)過程。

圖2 數(shù)據(jù)預(yù)處理和GSEA分析。

2）FVM和正常視網(wǎng)膜的免疫景觀

采用CIBERSORT計(jì)算32個(gè)樣品（26個(gè)FVM和6種正常視網(wǎng)膜）中22種類型的免疫細(xì)胞的浸潤。箱式圖展示了29個(gè)合格樣品中22種免疫細(xì)胞類型的比例（圖3A）。圖3B展示了免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性。其中靜止的肥大細(xì)胞和漿細(xì)胞之間表現(xiàn)出最強(qiáng)的正相關(guān)性（r = 0.6），而漿細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞之間的最強(qiáng)負(fù)相關(guān)性（r = -0.55）。兩組之間的免疫細(xì)胞浸潤比例差異如圖3C所示。與對照組相比，F(xiàn)VM組中濾泡輔助T細(xì)胞，M1巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞的百分比顯著增加，而漿細(xì)胞，活化的NK細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞的百分比顯著降低。如圖3D所示，F(xiàn)VM和正常視網(wǎng)膜組之間的完全分離表明，免疫細(xì)胞類型的浸潤可以用作PDR患者FVM的區(qū)別特征。

圖3. FVM和正常視網(wǎng)膜組織中的免疫浸潤景觀。

3）鑒定PDR浸潤免疫細(xì)胞相關(guān)基因

通過WGCNA分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)和免疫細(xì)胞類型。如圖4A所示，作者建立了一個(gè)無標(biāo)度拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)(soft-thresholding power=5, scale-free R2 = 0.9)。基于層次聚類方法，將高度共表達(dá)的基因聚類為不同的模塊和顏色編碼（圖4B）。在合并高度相關(guān)的模塊后，總共確定了28個(gè)包含14,132個(gè)基因的模塊（圖4B，C）。代表該模塊中所有基因的表達(dá)的ME與三種選定類型的免疫細(xì)胞的特征有關(guān)。其中，作者將與M2巨噬細(xì)胞最緊密相關(guān)的藍(lán)色模塊（r = 0.81，P = 1E-07）為hub模塊（圖4C，D）。該模塊包含718個(gè)基因，其中14個(gè)基因kME>0.9，被認(rèn)為是hub基因，并且可能起著重要的病理學(xué)作用。GO富集分析表明這14個(gè)基因與多個(gè)富含組織重塑過程和纖維化的條目相關(guān)。生物學(xué)過程（BP），分子功能（MF）和細(xì)胞成分（CC）中的前10個(gè)重要條目如圖4E所示，包括肌動(dòng)蛋白絲組織，細(xì)胞外基質(zhì)組織，肌動(dòng)纖維和肌動(dòng)蛋白結(jié)合等。這些數(shù)據(jù)表明這些hub基因通過調(diào)節(jié)M2巨噬細(xì)胞影響PDR進(jìn)展。

圖4. 通過WGCNA鑒定免疫細(xì)胞相關(guān)基因。

4）探索M2巨噬細(xì)胞相關(guān)生物標(biāo)志物。

為了鑒定可能促進(jìn)PDR發(fā)展的基因，作者分析了所有32個(gè)樣品的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。對比FVM和正常視網(wǎng)膜組后發(fā)現(xiàn)674個(gè)差異表達(dá)的基因（328個(gè)上調(diào)和346個(gè)下調(diào)）（圖5A）。將差異表達(dá)和M2巨噬細(xì)胞相關(guān)的基因取交集后一共獲得5個(gè)基因，分別是COL5A2, CALD1, COL6A3, CORO1C和CALU（圖5B）。對這5個(gè)基因進(jìn)行GO功能富集分析后發(fā)現(xiàn)，最高的GO條目劃痕愈合和組織修復(fù)等過程有關(guān)（圖5C），并且這些條目的富集與M2巨噬細(xì)胞的功能一致。此外，F(xiàn)VM組中這五個(gè)基因的表達(dá)顯著高于對照組（圖5D）。PCA結(jié)果顯示，整體數(shù)據(jù)集乃至單個(gè)數(shù)據(jù)集中的FVM樣品和正常視網(wǎng)膜樣品之間的完全分離（圖5E）。

圖5. M2巨噬細(xì)胞相關(guān)的生物標(biāo)志物的鑒定。

參考文獻(xiàn)

Zhishang Meng, Yanzhu Chen, Wenyi Wu, Bin Yan, Yongan Meng, Youling Liang, Xiaoxi Yao, Jing Luo. Exploring the Immune Infiltration Landscape and M2 Macrophage-Related Biomarkers of Proliferative Diabetic Retinopathy. Front Endocrinol (Lausanne). 2022 May 27;13:841813. doi: 10.3389/fendo.2022.841813. eCollection 2022.