癌癥相關(guān)成纖維細胞(CAFs)參與腫瘤生長、血管生成、轉(zhuǎn)移和治療抵抗。近日,有研究探索肝細胞癌(HCC)中CAFs的特征,并建立一個基于CAFs的風險標簽,用于預(yù)測HCC患者的預(yù)后。該研究發(fā)表在《Frontiers in immunology》,IF:8.786。
技術(shù)路線:
主要研究結(jié)果:
1. 篩選scRNA-seq樣品中的CAFs
本研究的流程圖如圖1所示。初步篩選后,從scRNA-seq數(shù)據(jù)中共獲得69,145個細胞(表1)。圖2A為21個樣本分布的TSNE圖,生成了4個CAF聚類 (圖2B)。4個CAF簇中共鑒定出211個DEGs,其中排名前5位的DEGs(被確定為CAF簇的標記基因)在4個簇中的表達如圖2C所示。每個隊列中4個集群的比例見圖2D。這些DEGs富集于多條通路,包括血管平滑肌收縮、黏著斑、催產(chǎn)素信號通路、PPARG信號通路等(圖2E)。此外,根據(jù)CNV特征,4個CAF簇由1533個腫瘤細胞和正常細胞組成(圖2F)。
圖1 本研究實驗流程圖
表1樣品過濾前后的細胞計數(shù)
圖2基于HCC患者scRNA-seq數(shù)據(jù)識別CAF集群
2. CAF中癌相關(guān)途徑的表達
不同CAF簇中10條腫瘤相關(guān)通路的GSVA評分如圖3A所示。CAF_0簇中的惡性細胞比例顯著高于其他三個簇(圖3B)。而CAF_1、CAF_2、CAF_3之間差異無統(tǒng)計學意義。進一步分析每個CAF簇中惡性與非惡性細胞間10條腫瘤相關(guān)通路的GSVA評分,發(fā)現(xiàn)有輕微差異(圖3C-F)。為了確定CAF集群和預(yù)后之間的關(guān)聯(lián),首先基于TCGA隊列計算了每個CAF集群的標記基因(圖2C中定義的CAF集群的前5個DEGs)的ssGSEA評分。結(jié)果表明,CAF_2簇在腫瘤樣本中的評分顯著高于正常樣本,而其他CAF簇的趨勢相反,正常樣本中的評分高于腫瘤樣本(圖4A)。根據(jù)survminer R包分析的最佳截斷值將TCGA數(shù)據(jù)集的HCC樣本分為高CAF評分組和低CAF評分組。高CAF評分組樣本在CAF_0、CAF_1和CAF_2簇中的預(yù)后優(yōu)于低CAF評分組樣本,而CAF_3與HCC的預(yù)后無關(guān)(圖4B-E)。上述結(jié)果表明,盡管肝癌和正常樣本的CAF_3富集不同,但CAF_3簇可能在肝癌進展中作用不大。
圖3 CAF簇中腫瘤相關(guān)通路的特征
圖4 4種CAF聚類與HCC患者預(yù)后的關(guān)系
3. 與CAF相關(guān)的關(guān)鍵基因的鑒定
為了構(gòu)建風險標簽,首先在腫瘤和正常組織之間篩選出DEGs。如圖5A所示,共獲得2349個DEGs,其中462個上調(diào),1887個下調(diào)。其中,有423個基因與這些預(yù)后相關(guān)的CAF集群顯著相關(guān)。進一步通過單因素Cox回歸分析評估每個基因的預(yù)后價值,有234個基因具有預(yù)后價值(圖5A, B)。Lasso Cox回歸分析縮小基因數(shù)量,剩下11個基因lambda=0.047(圖5C, D)。采用逐步回歸法進行多因素Cox回歸分析后,最終納入6個基因 (圖5E)。根據(jù)每個樣本的風險評分,將樣本分為高風險組和低風險組。在TCGA隊列和GEO隊列中,1 ~ 5年生存率模型的AUC值范圍分別為0.68 ~ 0.76和0.65 ~ 0.7(圖5F, G)。Kaplan-Meier生存分析顯示,高?;颊叩纳娼Y(jié)局顯著劣于低危患者(圖5H, I)。
圖5確定用于構(gòu)建風險標簽的核心預(yù)測基因
4. 關(guān)鍵基因突變及通路分析
檢測該風險標簽的6個基因的SNV突變情況。結(jié)果顯示,ADAMTSL2、SLCO2A1、HMGXB3、LUC7L3和CD4在更多的樣本中有SNV突變并均無顯著的共現(xiàn)概率,而GCN1中未觀察到SNV突變,且在這6個基因中只有非常少的樣本有CNV的獲得/丟失(圖S4A-C)。此外,SLCO2A1與非整倍體評分、同源重組缺陷、改變的部分、節(jié)段數(shù)量和非沉默突變率呈顯著負相關(guān),而HMGXB3、LUC7L3和GCN1與同源重組缺陷和改變的部分呈顯著正相關(guān)(圖S4D)。接下來,還分析了與每個風險基因相關(guān)的潛在通路,與這6個基因顯著相關(guān)的通路共有39條,包括血管生成、頂端連接、凋亡等(圖6A和B)。
圖S4風險特征中包含的基因突變的特征
圖6識別風險基因參與的通路
5. 核心基因與免疫的關(guān)系
ADAMTSL2、SLCO2A1和CD4與間質(zhì)評分、免疫評分和估計值呈顯著正相關(guān),而LUC7L3與間質(zhì)評分、免疫評分和估計值呈顯著負相關(guān)。然而,三種評分與其他基因(GCN1和HMGXB3)之間沒有觀察到顯著的相關(guān)性(圖S5A)。根據(jù)各基因表達量的中位數(shù)分組后,比較不同表達組的3個評分。結(jié)果顯示,對于ADAMTSL2、SLCO2A1和CD4基因,高表達組的三個評分均顯著高于低表達組(圖S5B)。相關(guān)性分析顯示ADAMTSL2、SLCO2A1、CD4與大部分T細胞呈顯著負相關(guān)。此外,LUC7L3、GCN1和HMGXB3與M0巨噬細胞和中性粒細胞呈顯著正相關(guān)(圖S5C)。幾種免疫細胞中風險基因的高表達組和低表達組之間存在顯著差異(圖S5D)。
圖S5風險基因與免疫景觀的關(guān)系
6. 風險特征對PD-L1阻斷免疫治療的反應(yīng)性
T細胞免疫療法已成為一種具有協(xié)同生存獲益的抗癌療法。IMvigor210隊列中的348例患者對抗PD- l1受體阻滯劑表現(xiàn)出不同程度的緩解,包括完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進展(PD)。SD/PD患者的風險評分高于CR/PR患者(圖7A)。在高危組中,SD/PD百分比高于低危組(圖7B)。在IMvigor210隊列中,與高危組患者相比,低危組患者顯示出顯著的臨床獲益和顯著較長的總生存期(圖7C, p=0.0053)。具體來說,I+II期患者在不同風險組之間有顯著的生存差異(圖7D, p=0.0017),但在III+IV期患者中無顯著差異(圖7E, p=0.5),提示風險評分在早期患者中更敏感。在GSE78220隊列中,還發(fā)現(xiàn)低危組患者的總生存期顯著長于高危組(圖7F, p=0.036),高危組的SD/PD百分比高于低危組(圖7G)。
圖7 IMvigor210隊列中風險評分對PD-L1阻斷免疫治療的反應(yīng)性
8. 確定獨立危險因素并繪制列線圖
多因素分析顯示,風險標簽是影響骨肉瘤患者預(yù)后的最重要的獨立因素,其次是轉(zhuǎn)移狀態(tài) (圖8A、B)。因此,構(gòu)建了聯(lián)合分期和風險評分的列線圖(圖8C)。校準圖顯示,列線圖可以有效預(yù)測實際生存結(jié)局(圖8D)。此外,DCA顯示列線圖對高?;颊叩淖R別能力優(yōu)于風險評分和分期(圖8E)。TimeROC分析顯示,風險評分和列線圖的AUC高于TCGA隊列中的其他指標(圖8F)。
圖8建立預(yù)測肝癌預(yù)后列線圖
結(jié)論:
綜上所述,該研究系統(tǒng)地描述了HCC中CAF群體的特征,并產(chǎn)生了4個具有顯著多樣性的CAF集群。4個聚類之間的DEGs富集在血管平滑肌收縮、黏著斑、催產(chǎn)素和PPARG信號通路等。其中3個基因簇與HCC預(yù)后顯著相關(guān),并用于構(gòu)建一個基于6個基因的預(yù)后風險標簽。作者觀察到基于CAF的基因標簽與免疫景觀相關(guān),可以用于預(yù)測對PD-L1阻斷免疫治療的反應(yīng)性。最后,基于風險標簽和臨床病理特征建立了一種新的列線圖模型,該模型對HCC患者的臨床結(jié)局具有良好的預(yù)測性能。