PLAA通過(guò)METTL3介導(dǎo)的TRPC3 mRNA m6A修飾抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移

廣泛轉(zhuǎn)移導(dǎo)致卵巢癌的高死亡率，了解其分子機(jī)制有助于找到轉(zhuǎn)移性卵巢癌治療的有效靶點(diǎn)。已發(fā)現(xiàn)PLAA在一些癌癥中失活，但其在癌癥轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚。在此，我們發(fā)現(xiàn)PLAA在卵巢癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系和患者中顯著下調(diào)，PLAA的低表達(dá)與患者的預(yù)后差和高危臨床病理特征相關(guān)。在原位異種移植小鼠模型中，PLAA抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲和移植瘤的轉(zhuǎn)移。同時(shí)，PLAA通過(guò)抑制TRPC3介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平來(lái)抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移。從機(jī)制上講，PLAA通過(guò)泛素介導(dǎo)的降解抑制METTL3的表達(dá)，而METTL3 mRNA通過(guò)m6A修飾穩(wěn)定TRPC3 mRNA的表達(dá)。我們的研究證實(shí)了PLAA-METTL3-TRPC3軸參與卵巢癌轉(zhuǎn)移的功能和機(jī)制，以期為卵巢癌提供潛在的治療途徑。本文于2022年7月發(fā)表于“Oncogene”（IF=8.756）上。

技術(shù)路線(xiàn)

結(jié)果

1）卵巢癌中PLAA下調(diào)，與預(yù)后呈正相關(guān)

通過(guò)LC-MS/MS分析，PLAA被確定為高轉(zhuǎn)移細(xì)胞中最顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)之一（圖1A）。PLAA的典型質(zhì)譜如圖1B所示。通過(guò)western blot和RT-qPCR驗(yàn)證了PLAA在具有不同轉(zhuǎn)移能力的卵巢癌細(xì)胞系（包括A2780-M、A2780、HO8910PM、HO8910）和正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE-80中的內(nèi)源性表達(dá)。結(jié)果表明，高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的PLAA低于親代細(xì)胞系，卵巢癌細(xì)胞的PLAA也低于正常卵巢細(xì)胞（圖1C、D）。我們還收集了56例卵巢癌新鮮組織樣本和12例卵巢良性腫瘤新鮮組織樣本進(jìn)行PLAA mRNA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)癌組織中PLAA mRNA顯著降低（圖1E）。此外，卵巢癌組織中PLAA蛋白的表達(dá)顯著低于良性腫瘤組織（圖1F）。有趣的是，與原發(fā)性卵巢癌相比，轉(zhuǎn)移性卵巢腫瘤中PLAA蛋白和mRNA的表達(dá)進(jìn)一步降低（圖1G）。為了了解PLAA的臨床意義，我們收集了79例卵巢癌患者的臨床病理資料以及他們的組織樣本，并進(jìn)行了免疫組化分析（圖1H）。Kaplan-Meier生存分析所示，低PLAA表達(dá)患者的無(wú)進(jìn)展生存期也比高PLAA表達(dá)的患者短（圖1I）。我們還分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果（圖1J）。我們的數(shù)據(jù)表明，低PLAA表達(dá)的患者生存期較短，PLAA可能是預(yù)測(cè)卵巢癌預(yù)后的潛在生物標(biāo)記物。

2）PLAA在體內(nèi)外抑制卵巢癌的遷移和侵襲

為了證實(shí)PLAA在卵巢癌中的生物學(xué)功能，建立了PLAA敲低或PLAA過(guò)表達(dá)細(xì)胞系（圖2A-D）。我們發(fā)現(xiàn)PLAA過(guò)表達(dá)顯著抑制細(xì)胞遷移和侵襲（圖2E，F(xiàn)），而PLAA下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲（圖2G，H）。接下來(lái)，我們利用原位異種移植模型研究了PLAA對(duì)卵巢癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。將A2780-M-PLAA-luc或A2780-M對(duì)照-luc細(xì)胞原位注射到卵巢上皮下（圖2I）。每周使用體內(nèi)成像系統(tǒng)（IVIS）監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展，6周后對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死。通過(guò)摘除原發(fā)腫瘤分別評(píng)估原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤（圖2J）。IVIS掃描顯示，與對(duì)照組相比，PLAA過(guò)表達(dá)顯著抑制了異種移植模型的轉(zhuǎn)移，而不會(huì)改變其原發(fā)腫瘤（圖2K）。H&E染色顯示卵巢癌原發(fā)腫瘤、網(wǎng)膜和腸轉(zhuǎn)移的典型形態(tài)（圖2L）。免疫組織化學(xué)染色分析顯示PLAA在原位異種移植模型中的過(guò)表達(dá)效率（圖2M）。我們的研究結(jié)果表明，PLAA在卵巢癌中起到了腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用。

3）TRPC3與PLAA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

為了了解PLAA抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制，分別對(duì)有PLAA下調(diào)和無(wú)PLAA下調(diào)的A2780細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。分層聚類(lèi)表明，PLAA敲低的細(xì)胞中有165個(gè)上調(diào)基因和109個(gè)下調(diào)基因（圖3A）。我們選擇了10個(gè)上調(diào)和10個(gè)下調(diào)基因，以驗(yàn)證它們?cè)赑LAA敲低的A2780和HO8910細(xì)胞中的表達(dá)，或在PLAA過(guò)表達(dá)的A2780-M和HO8910PM細(xì)胞中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)在這些差異表達(dá)的基因中，TRPC3是唯一在兩種細(xì)胞中以及兩個(gè)PLAA siRNA中持續(xù)上調(diào)表達(dá)的基因（圖3B）。相反，在PLAA過(guò)表達(dá)的A2780-M和HO8910PM細(xì)胞中，TRPC3下調(diào)（圖3C）。此外，經(jīng)驗(yàn)證，TRPC3蛋白表達(dá)在PLAA敲除時(shí)上調(diào)（圖3D），在PLAA過(guò)表達(dá)時(shí)下調(diào)（圖3E），以及與親代細(xì)胞相比在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞中下調(diào)（圖3G）。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)56例癌癥樣本中PLAA和TRPC3 mRNA的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（圖3G），IHC染色分析也顯示PLAA和TRPC3呈負(fù)相關(guān)（圖3H）。因此，這些結(jié)果證實(shí)TRPC3可能是卵巢癌中PLAA的潛在靶點(diǎn)。

4）TRPC3是一個(gè)癌基因，是PLAA的下游靶點(diǎn)

為了進(jìn)一步明確TRPC3在卵巢癌中的作用，我們首先檢測(cè)了臨床卵巢癌樣本中TRPC3的表達(dá)。我們證實(shí)，與良性卵巢腫瘤組織相比，卵巢癌組織中的TRPC3 mRNA顯著上調(diào)（圖4A），并且在卵巢癌組織的晚期比早期更高（圖4B）。此外，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的Kaplan–Meier生存分析表明，較高的TRPC3表達(dá)與較短的無(wú)進(jìn)展生存期相關(guān)（圖4C）。因此，我們根據(jù)TRPC3的基本水平建立了TRPC3敲除或TRPC3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型，并發(fā)現(xiàn)無(wú)論TRPC3被敲除或過(guò)表達(dá)，PLAA表達(dá)都保持不變（圖4D，E），但transwell分析顯示TRPC3敲低或用TRPC3抑制劑Pyr3治療，抑制A2780-M和HO8910PM細(xì)胞的遷移和侵襲（圖4F，G）。此外，我們還觀(guān)察到，PLAA過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的遷移和侵襲能力下降可通過(guò)TRPC3過(guò)表達(dá)恢復(fù)（圖4H）。相反，TRPC3 siRNA或Pyr3處理可消除PLAA敲除加速的遷移和侵襲能力（圖4I）。此外，我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，注射A2780-shPLAA-luc的小鼠表現(xiàn)出更廣泛的轉(zhuǎn)移，通過(guò)Pyr3治療可以顯著消除轉(zhuǎn)移，但在原發(fā)腫瘤中未檢測(cè)到顯著變化（圖4J）。我們的結(jié)果表明，PLAA以TRPC3依賴(lài)的方式抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移。

5）PLAA通過(guò)降低TRPC3介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣水平抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移

TRPC3是一種控制鈣相關(guān)信號(hào)的高鈣滲透性陽(yáng)離子通道。細(xì)胞內(nèi)鈣是一種多功能的第二信使，參與多種生物學(xué)行為，如癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在含有1.8 mM游離鈣的外部溶液中，我們觀(guān)察到當(dāng)TRPC3被敲低或用Pyr3處理時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平降低（圖5A、B）。相反，當(dāng)TRPC3過(guò)表達(dá)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增加，并且通過(guò)BAPTA-AM（一種公認(rèn)的細(xì)胞內(nèi)鈣螯合劑）治療恢復(fù)增加的Ca2+水平（圖5C）。我們進(jìn)一步觀(guān)察了鈣內(nèi)流對(duì)TRPC3促進(jìn)卵巢癌轉(zhuǎn)移的作用。正如預(yù)期的那樣，我們發(fā)現(xiàn)在經(jīng)BAPTA-AM處理的A2780和HO8910細(xì)胞中，TRPC3過(guò)表達(dá)促進(jìn)的遷移和侵襲被消除（圖5D）。此外，IVIS掃描顯示，與對(duì)照組相比，Pyr3或BAPTA-AM治療的異種移植模型的轉(zhuǎn)移受到明顯抑制，但在原發(fā)腫瘤中未檢測(cè)到明顯變化（圖5E）。此外，在含有1.8 mM游離鈣的外部溶液中，我們發(fā)現(xiàn)TRPC3下調(diào)或BAPTA-AM處理顯著降低了PLAA下調(diào)引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的升高（圖5F）。正如預(yù)期的那樣，BAPTA-AM也挽救了PLAA下調(diào)促進(jìn)的遷移和侵襲（圖5G）。我們的結(jié)果表明，PLAA通過(guò)下調(diào)TRPC3介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣水平抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移。

6）PLAA通過(guò)m6A修飾破壞TRPC3 mRNA的穩(wěn)定性

如上所述，PLAA可以直接調(diào)節(jié)TRPC3 mRNA水平。在此，我們發(fā)現(xiàn)PLAA敲低顯著增加了TRPC3 mRNA的穩(wěn)定性（圖6A），而PLAA過(guò)表達(dá)發(fā)揮了相反的作用（圖6B）?？紤]到m6A修飾是mRNA在轉(zhuǎn)錄后水平的常見(jiàn)調(diào)節(jié)模型，包括mRNA穩(wěn)定性。首先，我們敲低METTL3，并發(fā)現(xiàn)A2780和HO8910細(xì)胞中的TRPC3 m6A修飾水平（圖6C）、mRNA穩(wěn)定性（圖6D）、mRNA水平（圖5E）和蛋白質(zhì)水平（補(bǔ)充圖）顯著降低。為了進(jìn)一步證明m6A在調(diào)節(jié)TRPC3中的重要作用，我們建立了一個(gè)抗m6A修飾的突變TRPC3（圖6F），并發(fā)現(xiàn)當(dāng)METTL3沉默時(shí)，在轉(zhuǎn)染TRPC3-WT質(zhì)粒的細(xì)胞中，熒光素酶活性降低（圖6G）。此外，為了研究PLAA是否通過(guò)m6A修飾介導(dǎo)TRPC3，我們進(jìn)行了拯救試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)由PLAA缺失引起的m6A修改水平升高和TRPC3 mRNA半衰期延長(zhǎng)被METTL3敲除所逆轉(zhuǎn)（圖6H，I）。此外，通過(guò)METTL3的衰減也可以恢復(fù)PLAA敲除誘導(dǎo)的TRPC3 mRNA和蛋白水平的升高（圖6J，K）。我們的結(jié)果表明，PLAA通過(guò)m6A修飾調(diào)節(jié)TRPC3 mRNA的表達(dá)。

7）PLAA通過(guò)泛素介導(dǎo)途徑促進(jìn)卵巢癌METTL3降解

由于PLAA通過(guò)m6A修飾來(lái)調(diào)節(jié)TRPC3 mRNA的表達(dá)，因此我們檢測(cè)了m6A修飾的相關(guān)蛋白。我們發(fā)現(xiàn)在PLAA敲低的細(xì)胞中，METTL3顯著升高（圖7A），這表明TRPC3 mRNA受METTL3.調(diào)節(jié)。此外，RNA免疫沉淀分析表明，與IgG對(duì)照組相比，METTL3特異性抗體顯著富集了TRPC3 mRNA，而PLAA的敲除顯著增強(qiáng)了A2780和HO8910細(xì)胞中TRPC3的mRNA富集（圖7B）?？紤]到PLAA下調(diào)對(duì)METTL3的mRNA水平?jīng)]有影響（圖7C），我們認(rèn)為蛋白水平的變化可能是PLAA下調(diào)組METTL3mRNA上調(diào)的主要原因。因此，我們用環(huán)己酰亞胺（CHX）處理A2780和HO8910細(xì)胞以抑制蛋白質(zhì)生物合成，并發(fā)現(xiàn)在PLAA敲除的細(xì)胞中METTL3蛋白的半衰期顯著延長(zhǎng)（圖7D）。我們進(jìn)一步觀(guān)察到蛋白酶體抑制劑MG132治療后，PLAA過(guò)表達(dá)的A2780-M和HO8910PM細(xì)胞中METTL3蛋白表達(dá)恢復(fù)（圖7E）。這些結(jié)果表明METTL3是通過(guò)泛素介導(dǎo)的降解途徑降解的。因此，我們進(jìn)行泛素化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PLAA下調(diào)減少了A2780和HO8910細(xì)胞中METTL3的泛素化（圖7F）。這些結(jié)果表明，PLAA通過(guò)泛素介導(dǎo)的降解途徑抑制METTL3蛋白的表達(dá)。

結(jié)論：

我們的研究表明，下調(diào)的PLAA與卵巢癌轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后不良相關(guān)，PLAA通過(guò)調(diào)節(jié)TRPC3和細(xì)胞內(nèi)鈣水平抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并抑制小鼠原位異種移植的轉(zhuǎn)移。PLAA通過(guò)蛋白酶體降解途徑下調(diào)METTL3，METTL3-介導(dǎo)的m6A修飾有助于PLAA調(diào)節(jié)TRPC3 mRNA。我們的研究結(jié)果表明PLAA在卵巢癌轉(zhuǎn)移中的抑制作用以及潛在機(jī)制，這可能為臨床阻斷卵巢癌轉(zhuǎn)移提供一種潛在的途徑。

參考文獻(xiàn)：

Shen Z, Gu L, Liu Y, Wang L, Zhu J, Tang S, Wei X, Wang J, Zhang S, Wang X, Cheng X, Xie X, Lu W. PLAA suppresses ovarian cancer metastasis via METTL3-mediated m6A modification of TRPC3 mRNA. Oncogene. 2022 Aug;41(35):4145-4158. doi: 10.1038/s41388-022-02411-w.