METTL14介導(dǎo)的circORC5的m6A修飾通過調(diào)節(jié)miR-30c-2-3p/AKT1S1軸抑制胃癌進(jìn)展
N6-甲基腺苷(m6A) RNA甲基化和環(huán)狀RNAs (circRNAs)在包括胃癌(GC)在內(nèi)的多種惡性腫瘤中起著重要作用。然而，關(guān)于circRNAs的m6A修飾如何促進(jìn)GC進(jìn)展的知識很少。我們采用Western blot和免疫組化評估METTL14表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。通過體外和體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)研究METTL14在GC中的作用。通過RT-qPCR和Western blot分析，評估METTL14和(或)circORC5對miR-30c-2-3p介導(dǎo)的AKT1S1和EIF4B的影響。我們發(fā)現(xiàn)METTL14在胃癌組織樣本中表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)是胃癌患者生存不良的前兆因素。異位表達(dá)METTL14在體內(nèi)外均能顯著抑制GC細(xì)胞的生長和侵襲，而敲除METTL14則具有相反的作用。機(jī)械上，m6A-circRNA轉(zhuǎn)錄微陣列和Me-RIP將circORC5識別為METTL14的下游靶點(diǎn)。沉默METTL14降低了circORC5的m6A水平，但增加了circORC5的表達(dá)。此外，circORC5可以海綿miR-30c-2-3p，并逆轉(zhuǎn)METTTL14引起的miR-30c-2-3p的上調(diào)以及AKT1S1和EIF4B的下調(diào)。circORC5與miR-30c-2-3p呈負(fù)相關(guān)，在GC中生存率較低。我們的研究結(jié)果表明，METTL14介導(dǎo)的circORC5的m6A修飾通過調(diào)節(jié)miR-30c-2-3p/AKT1S1軸抑制胃癌進(jìn)展。本文于2022年2月發(fā)表于Molecular Cancer (IF=41.444)上。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
(1) METTL14基因下調(diào)預(yù)示GC患者預(yù)后不良
為了研究METTL14在GC中的潛在作用，我們首先分析了TCGA的RNA測序數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，與正常組織相比，人類GC組織樣本中METTL14的表達(dá)降低了(圖1A，P<0.05)。我們進(jìn)一步通過Western blot檢測了10個(gè)配對GC組織樣本中METTL14的蛋白水平，結(jié)果顯示，與配對正常樣本相比，GC中METTL14明顯下調(diào)(圖1B,C, P<0.0001)。組織芯片包含90對癌組織和匹配的正常組織，通過IHC染色分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了GC組織中METTL14的下調(diào)(圖1D, P=0.029)。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，METTL14低表達(dá)患者的總生存率較高表達(dá)患者差(圖1E, P=0.042)。從GSE22377中提取TCGA和GC患者的臨床資料，建立獨(dú)立的兩個(gè)隊(duì)列。與我們的結(jié)果一致的是，低表達(dá)的METTL14在胃癌中的生存率較低(圖1E, P<0.01)。這些結(jié)果提示METTL14是GC患者的一個(gè)可靠的預(yù)后因子。
圖1：胃癌患者METTL14基因下調(diào)與預(yù)后不良相關(guān)。
(2) 敲除METTL14促進(jìn)了GC的增殖和侵襲
鑒于METTL14在胃癌組織中的表達(dá)減少，我們推測METTL14可能在胃癌中起抑癌作用。我們通過RT-qPCR和Western blot檢測正常胃上皮細(xì)胞系(GES1)和GC細(xì)胞系(SGC-7901、MKN28、BGC-823、AGS和MGC-803)中METTL14的mRNA和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)METTL14在AGS和MGC-803中高表達(dá)，而在SGC-7901中低表達(dá)(圖2A)。因此，為了確認(rèn)METTL14在GC中的作用，我們用siRNA在AGC和MGC-803細(xì)胞中建立了METTL14敲除細(xì)胞模型，用質(zhì)粒在SGC-7901細(xì)胞中建立了METTL14過表達(dá)細(xì)胞模型。通過RT-qPCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率(圖2B)。正如預(yù)期的那樣，METTL14的敲除顯著促進(jìn)了細(xì)胞活力(圖2C)和增殖潛能(圖2D)。此外，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，METTL14的下調(diào)顯著促進(jìn)了GC細(xì)胞的侵襲能力(圖2E)。同樣，與對照組相比，過表達(dá)的METTL14對細(xì)胞活力(圖2C)、集落形成(圖2D)和侵襲能力(圖2E)均表現(xiàn)出抑制作用。
圖2：METTL14基因敲除促進(jìn)GC增殖和侵襲。
(3) METTL14通過circORC5的m6A依賴性修飾發(fā)揮作用
為了闡明METTL14在GC進(jìn)展中的潛在機(jī)制，我們首先通過MeRIP檢測了METTL14對MGC-803和AGS細(xì)胞中m6A水平的影響，結(jié)果顯示METTL14敲低的MGC803和AGS細(xì)胞中m6A水平明顯降低(圖3A)。m6A-circRNA轉(zhuǎn)錄芯片顯示，與對照組相比，METTL14敲低的MGC-803細(xì)胞中m6A水平升高的circRNAs有444個(gè)，m6A水平下降的circRNAs有454個(gè)(圖3B)，其中，hsa_circ_0030632、hsa_circ_0047481和hsa_circ_007612是METTL14敲低的細(xì)胞中m6A水平下調(diào)最多的三個(gè)circRNAs (圖3C)。MeRIP-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了MGC-803和AGS細(xì)胞中，METTL14的敲除降低了hsa_circ_0007612 (circORC5)的m6A水平，而不是hsa_circ_0030632和hsa_circ_0047481的m6A水平(圖3D)，而RT-qPCR分析顯示MGC-803和AGS細(xì)胞中METTL14的敲除提高了circORC5的mRNA水平(圖3E)。在功能上，我們發(fā)現(xiàn)circORC5的缺失降低了MGC-803和AGS細(xì)胞集落的形成和侵襲能力，并抵消了si-METTL14誘導(dǎo)的集落形成和侵襲潛能(圖3F,G)。這些結(jié)果表明，METTL14通過circORC5的m6A依賴性修飾發(fā)揮作用。
圖3：METTL14通過circORC5的m6A依賴性修飾發(fā)揮作用。
(4) GC中circORC5的鑒定及特征
根據(jù)環(huán)狀RNA交互組中的circRNA注釋，hsa_circ_0007612來源于線性基因起源識別復(fù)合體亞基5 (ORC5)，命名為circORC5(圖4A)。與線性O(shè)RC5相比，經(jīng)RNase R外切酶處理后，circORC5具有更高的穩(wěn)定性(圖4B)。細(xì)胞質(zhì)和核RNA分析顯示，circORC5在MGC-803和AGS細(xì)胞中優(yōu)先定位在細(xì)胞質(zhì)中(圖4C)。FISH進(jìn)一步驗(yàn)證了circORC5的綠色熒光分布主要在GC的細(xì)胞質(zhì)中(圖4D)，與相鄰正常組織相比，circORC5在GC組織中的表達(dá)增加(圖4E)。Kaplan-Meier發(fā)現(xiàn)，與circORC5低表達(dá)的GC患者相比，circORC5高表達(dá)的GC患者生存期較差(圖4F)。
圖4：circORC5的鑒定及特征。
(5) circORC5與GC中miR-30c-3p呈負(fù)相關(guān)
根據(jù)m6A-circRNA譜分析和miRbase，我們發(fā)現(xiàn)circORC5具有與5種miRNAs結(jié)合的潛力(圖5A)。我們分析了這五種miRNAs在GC中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-30c-2-3p在387個(gè)未配對的GC組織和41個(gè)配對的GC組織中下降最為顯著(圖5B, P<0.0001)。FISH分析進(jìn)一步證實(shí)，miR-30c-2-3p表達(dá)水平在GC組織中顯著下調(diào)，且與circORC5呈負(fù)相關(guān)(圖5C,D)。FISH分析表明，circORC5也定位于GC組織的細(xì)胞質(zhì)中(圖5E)。
圖5：circORC5在GC中與miR-30c-2-3p呈負(fù)相關(guān)。
(6) circORC5在GC中充當(dāng)miR-30c-2-3p的海綿
圖6A顯示了miR-30c-2-3p與circORC5的結(jié)合位點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)，在MGC-803和AGS細(xì)胞中，與miR-NC組相比，miR-30c-2-3p模擬物可以降低WT circORC5 3'-非翻譯區(qū)(UTR)的熒光素酶活性，但對Mut circORC5 3'-UTR的熒光素酶活性沒有影響(圖6B)。RT-qPCR分析顯示，MGC-803和AGS細(xì)胞中，circORC5敲低或METTL14過表達(dá)可顯著增加miR30c-2-3p的表達(dá)(圖6C)，但miR-30c-2-3p模擬物對circORC5表達(dá)無影響(補(bǔ)充圖未展示)。此外，我們在MGC-803和AGS細(xì)胞中對Ago2進(jìn)行RNA免疫沉淀(RIP)，并通過RT-qPCR分析從Ago2表達(dá)的細(xì)胞中拉下的內(nèi)源性circORC5和miR-30c-2-3p水平，結(jié)果表明，與輸入對照組相比，Ago2顆粒中circORC5和miR-30c-2-3p高度富集(圖6D,E)。在功能上，miR-30c-2-3p抑制劑促進(jìn)了MGC-803和AGS細(xì)胞的細(xì)胞活力，逆轉(zhuǎn)了circORC5敲除誘導(dǎo)的抗增殖作用(圖6F)。
圖6：circORC5在GC中充當(dāng)miR-30c-2-3p的海綿。
(7) METTL14介導(dǎo)circORC5調(diào)節(jié)miR-30c-2-3p/AKT1S1軸
為了驗(yàn)證METTL14是否介導(dǎo)circORC5調(diào)節(jié)miR-30c-2-3p的表達(dá)，RT-qPCR分析顯示，在MGC-803和AGS細(xì)胞中，下調(diào)circORC5增加了miR-30c-2-3p的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了下調(diào)METTL14對miR-30c-2-3p表達(dá)的抑制作用(圖7A)。接下來，我們將AKT1底物1 (AKT1S1)和真核翻譯起始因子4B (EIF4B)確定為miR-30c-2-3p的靶點(diǎn)，并將miR-30c-2-3p與AKT1S1/EIF4B潛在結(jié)合位點(diǎn)的示意圖列出(補(bǔ)充圖未展示)。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在MGC-803和AGS細(xì)胞中，與miR-NC組相比，miR-30c-2-3p模擬物可以降低WT AKT1S1和EIF4B 3’UTR的熒光素酶活性，但對Mut AKT1S1和EIF4B 3’UTR的熒光素酶活性沒有影響(圖7B,C)。同時(shí)，miR-30c-2-3p模擬物可下調(diào)AKT1S1和EIF4B的表達(dá)(圖7D,E)。進(jìn)一步的Western blot顯示，METTL14敲低顯著上調(diào)MGC-803和AGC細(xì)胞中AKT1S1和EIF4B的表達(dá)，而這種影響可通過敲低circORC5逆轉(zhuǎn)(圖7E)。
圖7：METTL14介導(dǎo)circORC5調(diào)節(jié)miR-30c-2-3p/AKT1S1軸。
為了研究METTL14在體內(nèi)是否抑制腫瘤生長，我們建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染METTL14或NC的SGC-7901細(xì)胞系，然后將其皮下注射到裸鼠的腹部。觀察33天后，我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染METTL14的SGC-7901細(xì)胞誘導(dǎo)的移植瘤體積小于轉(zhuǎn)染NC的細(xì)胞(圖8A)。生長曲線顯示，METTL14轉(zhuǎn)染組腫瘤呈時(shí)間依賴性減少(圖8B)，與NC組相比，METTL14轉(zhuǎn)染組腫瘤體積和重量均有所減輕(圖8C)。HE和IHC染色顯示，與NC組相比，METTL14轉(zhuǎn)染組腫瘤增殖標(biāo)志物Ki-67下調(diào)(圖8D)。
圖8：METTl14在體內(nèi)抑制腫瘤生長。
結(jié)論：
在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-30c-2-3p或circORC5的敲除會(huì)降低ElF4B和AKT1S1的表達(dá)，circORC5的缺失逆轉(zhuǎn)了METTL14敲除對GC細(xì)胞中ElF4B和AKT1S1表達(dá)的促進(jìn)作用。結(jié)果表明，METTL14通過提高circORC5的m6A水平和降低其表達(dá)來抑制GC的生長，circORC5海綿化miR-30c2-3p并上調(diào)ElF4B和AKT1S1，促進(jìn)GC的腫瘤發(fā)生(圖9)。綜上所述，METTL14的下調(diào)與胃癌患者的生存率差相關(guān)，METTL14介導(dǎo)的circORC5的m6A修飾通過調(diào)節(jié)miR-30c-2-3p/AKT1S1軸抑制胃癌細(xì)胞的生長和侵襲，可能為胃癌提供一個(gè)有希望的預(yù)后因子。
圖9：GC中的METTL14機(jī)制示意圖。METTL14增加了circORC5的m6A水平，抑制了circORC5的表達(dá)，從而上調(diào)了miR-30c-2-3p，下調(diào)了AKT1S1和EIF4AB，抑制了GC的進(jìn)展。
參考文獻(xiàn)：Fan, H. N., Chen, Z. Y., Chen, X. Y., Chen, M., Yi, Y. C., Zhu, J. S., & Zhang, J. (2022). METTL14-mediated m6A modification of circORC5 suppresses gastric cancer progression by regulating miR-30c-2-3p/AKT1S1 axis. Molecular cancer, 21(1), 51. https://doi.org/10.1186/s12943-022-01521-z.