長鏈非編碼 RNA MIR4435-2HG通過重編程中性粒細(xì)胞抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展

作為全球惡性腫瘤的第三大病因，結(jié)直腸癌在起始和進(jìn)展階段受lncRNA異常表達(dá)和突變的調(diào)控。之前的研究發(fā)現(xiàn)MIR4435-2HG作為多種腫瘤類型的癌基因,但MIR4435-2HG在腫瘤基質(zhì)或微環(huán)境中的作用及其詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制，仍然未知。髓源性抑制細(xì)胞 (MDSC) 是一種異質(zhì)細(xì)胞群，包括病理活化的單核細(xì)胞和相對不成熟的中性粒細(xì)胞，lncRNAs 在 MDSCs 中的作用尚未得到詳細(xì)闡明。該研究發(fā)表于《Cancer Immunology Research》，IF:12.02。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 腫瘤細(xì)胞內(nèi)的MIR4435-2HG在體外對結(jié)直腸癌細(xì)胞沒有生物學(xué)作用

為了探索MIR4435-2HG在結(jié)直腸癌中的作用，作者分析了來自癌癥基因組圖譜 (TCGA) 和符合條件的基因表達(dá)綜合 (GEO) 數(shù)據(jù)庫的 10 個公共數(shù)據(jù)集（包括 10 多對正常-腫瘤結(jié)直腸癌樣本），結(jié)果顯示在 7 個數(shù)據(jù)集中，與成對的相鄰正常組織相比，MIR4435-2HG在腫瘤組織中上調(diào)。因此，作者進(jìn)行了薈萃分析以確認(rèn)MIR4435-2HG在結(jié)直腸癌中過表達(dá)（圖 1A）。

接下來，作者檢測了MIR4435-2HG在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位。MIR4435-2HG在 SW480 和 RKO 細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均具有較高的表達(dá)。作者通過 SW480 細(xì)胞中的 CRISPR/Cas9 敲除MIR4435-2HG，并通過 SW480 和 RKO 細(xì)胞中的 siRNA 敲低MIR4435-2HG。在結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中敲除或敲除MIR4435-2HG對增殖、遷移或侵襲均沒有影響。與這些發(fā)現(xiàn)一致，MIR4435-2HG的異位表達(dá)在 DLD1 和 HCT116 細(xì)胞中沒有改變它們的增殖、遷移或侵襲。RNA范圍顯示MIR4435-2HG在腫瘤基質(zhì)中高表達(dá)，但在結(jié)直腸癌細(xì)胞和鄰近的正常上皮細(xì)胞中表達(dá)非常低（圖1B），這可能解釋了為什么MIR4435-2HG在腫瘤組織中高表達(dá)但沒有生物學(xué)效應(yīng)在結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)。

2. Mir4435-2hg缺失促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生和進(jìn)展

目前尚不清楚腫瘤基質(zhì)中的MIR4435-2HG是否在結(jié)直腸癌發(fā)展中發(fā)揮生物學(xué)作用。作者通過 CRISPR/Cas9 刪除Mir4435-2hg基因座產(chǎn)生了Mir4435-2hg 缺陷小鼠。與之前的報告一致，Mir4435-2hg的缺失導(dǎo)致中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞減少，但淋巴細(xì)胞不減少。刪除Mir4435-2hg后未觀察到其他主要器官發(fā)育或血脂異常的明顯改變。然后，作者將小鼠結(jié)腸炎相關(guān)（AOM/DSS）結(jié)直腸癌模型分為三個隊列，包括短期、經(jīng)典長期和長期腫瘤模型（圖 1C），它們在分子水平上類似于人類結(jié)直腸癌的進(jìn)展，包括Apc突變和 β-連環(huán)蛋白易位。雖然短期腫瘤模型的結(jié)直腸腺瘤不足以進(jìn)行肉眼觀察，但 H&E 染色顯示Mir4435-2hg -/-小鼠比野生型 (WT) 小鼠攜帶更多的結(jié)直腸腺瘤和淋巴濾泡（圖 1D - F）。通過經(jīng)典術(shù)語模型的大體觀察和 H&E 染色，作者在Mir4435-2hg -/-小鼠中發(fā)現(xiàn)比 WT 小鼠更多的腫瘤、更大的腫瘤大小和更高的腫瘤負(fù)荷（圖 1G - K）。然而，長期模型的大體觀察和 H&E 染色均未顯示Mir4435-2hg -/-小鼠和 WT 小鼠之間的腫瘤數(shù)量或腫瘤大小存在顯著差異（圖 1L - O）。進(jìn)一步的組織學(xué)分析（圖 1M）顯示所有來自Mir4435-2hg -/-小鼠的腫瘤，但只有 40% 來自 WT 小鼠，已穿透黏膜肌層進(jìn)入黏膜下層（圖 1P ））。另一組 AOM/DSS 模型接受了生存分析（第 30 周），而Mir4435-2hg -/-小鼠的生存率較差（圖 1Q）。

接下來，將Apc Min/ +小鼠（一種自發(fā)性腸腺瘤性息肉病的動物模型）與Mir4435-2hg -/-小鼠雜交以模擬自發(fā)性腫瘤。在來自Apc Min/ +小鼠的正常組織中，在腸腫瘤中檢測到更高的 Mir4435-2hg表達(dá)。然而，在Apc Min/ + / Mir4435-2hg -/-小鼠中觀察到更多的腸腫瘤（圖 1R）。作者還發(fā)現(xiàn)Apc Min/ + / Mir4435-2hg-/-小鼠的預(yù)后比Apc Min/ + /WT 小鼠差（圖 1S）。總之，這些數(shù)據(jù)表明Mir4435-2hg缺失有助于散發(fā)性結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，應(yīng)被視為腫瘤抑制 lncRNA。

圖1 Mir4435-2hg缺失促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展

3. MIR4435-2HG通過重塑免疫微環(huán)境來調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的發(fā)展

為了證明Mir4435-2hg如何調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的進(jìn)展，作者通過 RNA-seq 對來自 WT 和Mir4435-2hg -/- AOM/DSS 小鼠的腫瘤組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。Mir4435-2hg缺失導(dǎo)致 92 個基因顯著上調(diào)，138 個基因顯著下調(diào)（圖 2A），通過 qRT-PCR 進(jìn)一步驗證了它們的代表性基因。根據(jù)基因本體（GO）富集分析，這些差異表達(dá)的基因主要富集于免疫反應(yīng)生物學(xué)過程，包括炎癥反應(yīng)、中性粒細(xì)胞趨化性、免疫系統(tǒng)過程、抗原加工和呈遞（圖2B和C）。

為了排除 AOM/DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎引起的副作用，作者還收集了Apc Min/ + / Mir4435-2hg -/-和Apc Min/ + /WT 小鼠的腫瘤組織用于 RNA-seq 分析。與 AOM/DSS 模型一致，上調(diào)基因的 GO 富集分析表明，大多數(shù)基因與腫瘤免疫相關(guān)生物學(xué)過程相關(guān)，例如淋巴細(xì)胞趨化性、對干擾素-γ 的細(xì)胞反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和中性粒細(xì)胞趨化性。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了Mir4435-2hg可能通過調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的免疫微環(huán)境發(fā)揮抑癌作用。

為了驗證這一假設(shè)，將同系鼠結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系 MC38 皮下接種到Mir4435-2hg -/-和 WT 小鼠中。作者發(fā)現(xiàn)腫瘤在Mir4435-2hg -/-小鼠中生長得更快（圖 2D）。Mir4435-2hg -/-小鼠的腫瘤體積和重量也顯著大于WT小鼠（圖2E和F），Mir4435-2hg -/-小鼠的腫瘤形成率顯著高于WT小鼠。

為了進(jìn)一步證明腫瘤基質(zhì)中而非腫瘤細(xì)胞中的 Mir4435-2hg 調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的發(fā)展，作者用 CRISPR/Cas9 敲除MC38細(xì)胞中的Mir4435-2hg。Mir4435-2hg敲除沒有改變它們的增殖、遷移或侵襲。MC38 和 CT26 細(xì)胞中三種Mir4435-2hg變體的過表達(dá)對增殖和遷移也幾乎沒有影響。將 Mir4435-2hg敲除 MC38 和模擬敲除細(xì)胞同步注射到Mir4435-2hg -/-和 WT 小鼠中。淘汰Mir4435-2hg在 MC38 細(xì)胞中不影響Mir4435-2hg -/-或 WT 小鼠的腫瘤增殖；然而，Mir4435-2hg -/-小鼠的微環(huán)境顯著促進(jìn)了腫瘤的生長，不僅是模擬細(xì)胞，還有Mir4435-2hg敲除 MC38 細(xì)胞（圖 2G）。腫瘤體積和重量也觀察到類似的表型（圖 2H和I）。接下來，作者從Mir4435-2hg -/-和 WT 小鼠中分離脾細(xì)胞以與 MC38 細(xì)胞共培養(yǎng)。正如預(yù)期的那樣，與脾細(xì)胞共培養(yǎng)時，MC38細(xì)胞的凋亡率更高，但Mir4435-2hg的脾細(xì)胞降低了MC38細(xì)胞的凋亡率。-/-小鼠與 WT 小鼠相比（圖 2J和K）。

總體而言，這些數(shù)據(jù)表明MIR4435-2HG可能通過重塑結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境發(fā)揮抗癌作用。

圖2 MIR4435-2HG通過重塑免疫微環(huán)境來調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的發(fā)展

4. Mir4435-2hg耗竭增加結(jié)直腸癌中的 PMN-MDSCs

Mir4435-2hg可以通過等位基因特異性抑制Bim表達(dá)來控制嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的壽命。然而，目前尚不清楚結(jié)直腸癌基質(zhì)中哪種類型的細(xì)胞表達(dá)Mir4435-2hg。因此，作者在人結(jié)直腸癌組織中進(jìn)行了 RNAscope 分析，結(jié)果表明MIR4435-2HG主要位于中性粒細(xì)胞中（圖 3A）。接下來，作者監(jiān)測了皮下腫瘤生長過程中外周血中主要白細(xì)胞的數(shù)量變化。與以前的報告一致，荷瘤小鼠的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞增加，淋巴細(xì)胞減少。Mir4435-2hg -/-小鼠的單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞仍然低于WT小鼠，但隨著腫瘤的生長，Mir4435-2hg -/-小鼠的中性粒細(xì)胞數(shù)量逐漸達(dá)到與WT小鼠相同的頻率（圖3B）。

荷瘤小鼠中的中性粒細(xì)胞是異源的，包括經(jīng)典的中性粒細(xì)胞和 PMN-MDSCs。根據(jù)作者上面的數(shù)據(jù)，作者假設(shè)Mir4435-2hg不能控制 PMN-MDSC 的壽命，并且攜帶腫瘤的Mir4435-2hg -/-小鼠中升高的中性粒細(xì)胞主要是 PMN-MDSC。因此，作者在無腫瘤和有腫瘤的 WT 和Mir4435-2hg -/-小鼠中檢測到中性粒細(xì)胞的凋亡。無腫瘤Mir4435-2hg -/-小鼠的中性粒細(xì)胞凋亡明顯多于 WT 小鼠。然而，在荷瘤小鼠中，Mir4435-2hg中的中性粒細(xì)胞凋亡減少-/-和 WT 小鼠，這可能是由 MC38 細(xì)胞產(chǎn)生的 GM-CSF 造成的，在荷瘤Mir4435-2hg -/-小鼠中，中性粒細(xì)胞凋亡率降低到與荷瘤 WT 小鼠相同的水平（圖 3C和D）。在BM衍生的PMN-MDSCs中，作者還觀察到在用MC38腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基處理后細(xì)胞凋亡率降低，尤其是在Mir4435-2hg -/-細(xì)胞中（圖3E）。

因為Mir4435-2hg通過抑制Bim表達(dá)來調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞凋亡，作者檢測到 BIM 蛋白在中性粒細(xì)胞中的表達(dá)。BIM 在無腫瘤和攜帶腫瘤的Mir4435-2hg -/-小鼠中均上調(diào)，并且攜帶腫瘤不改變 BIM 的表達(dá)（圖 3F和G）。Bcl2 家族通過形成同源二聚體或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。因此，作者檢測到所有抗凋亡 Bcl2 家族成員的變化。其中，來自 WT 或Mir4435-2hg -/-小鼠的 BM 衍生的 PMN-MDSC 中只有Bcl2l1通過 MC38 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基的刺激而上調(diào)（圖 3H），而Bcl2和Bcl2a1a被下調(diào)，而Bcl2l2和Mcl1未改變。流式細(xì)胞術(shù)還顯示來自 WT 和Mir4435-2hg -/-荷瘤小鼠的中性粒細(xì)胞中 BCL2L1 的表達(dá)升高（圖 3I和J）。這些結(jié)果表明，PMN-MDSCs 中 BCL2L1 的表達(dá)升高可能會拮抗 Mir4435-2hg -/- 小鼠中增加的 BIM 的功能，幫助荷瘤Mir4435-2hg -/-小鼠中的中性粒細(xì)胞恢復(fù)到與在WT小鼠中并導(dǎo)致更高比例的PMN-MDSC。

圖3 Mir4435-2hg消耗增加 PMN-MDSC

單細(xì)胞 RNA-seq 分析已將 CD14 鑒定為 PMN-MDSCs 的標(biāo)志物，用于區(qū)分荷瘤小鼠中的經(jīng)典中性粒細(xì)胞。在作者的研究中，在攜帶腫瘤的Mir4435-2hg -/-小鼠的脾中性粒細(xì)胞中觀察到的 CD14 +細(xì)胞比例顯著高于來自 WT 小鼠的那些。即使在無腫瘤小鼠中，Mir4435-2hg -/-小鼠也比WT小鼠攜帶更高比例的CD14 +中性粒細(xì)胞（圖3K和L）。作者還通過流式細(xì)胞術(shù)研究了皮下腫瘤內(nèi)幾種類型的腫瘤浸潤免疫細(xì)胞。在Mir4435-2hg中檢測到更高比例的中性粒細(xì)胞-/-小鼠比 WT 小鼠（圖 4A）。在中性粒細(xì)胞室內(nèi)，CD14 +細(xì)胞的百分比在 WT 小鼠中達(dá)到平均 85.7%，在Mir4435-2hg -/-小鼠中達(dá)到 93.0%（圖4B），這表明腫瘤浸潤性中性粒細(xì)胞主要是增加的 PMN-MDSCs在Mir4435-2hg -/-小鼠的腫瘤內(nèi)。相反，CD3 + T 細(xì)胞和 CD8 + T 細(xì)胞減少（圖 4C和D）。Mir4435-2hg -/-小鼠的單核細(xì)胞/M-MDSCs 也顯著減少，而總 CD45 +細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和 M2 巨噬細(xì)胞沒有改變（圖4E-H）。在 AOM/DSS 結(jié)直腸癌模型中也觀察到了類似的結(jié)果；通過IHC，與WT小鼠相比，Mir4435-2hg -/-小鼠的腫瘤浸潤性PMN-MDSCs顯著增加，CD8 + T細(xì)胞減少（圖4I）。這些數(shù)據(jù)表明，Mir4435-2hg的丟失可能導(dǎo)致 PMN-MDSCs 的增加，這有助于免疫抑制環(huán)境。

圖4 Mir4435-2hg耗竭導(dǎo)致腫瘤浸潤性 PMN-MDSC 增加和 T 細(xì)胞減少

5. Mir4435-2hg 的缺失增強(qiáng)了 PMN-MDSCs 的免疫抑制潛力

為了研究Mir4435-2hg調(diào)節(jié) PMN-MDSCs 的生物學(xué)機(jī)制，作者對來自 BM 的中性粒細(xì)胞進(jìn)行了 RNA-seq，結(jié)果顯示 429 個下調(diào)基因和 336 個上調(diào)基因（圖 5A）。GO富集分析表明，下調(diào)基因富集于有絲分裂相關(guān)的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞分裂、有絲分裂核分裂和有絲分裂中心體分離的調(diào)節(jié)。由于 MDSCs 被認(rèn)為是相對不成熟的骨髓細(xì)胞，這些結(jié)果可能表明Mir4435-2hg -/-小鼠中的中性粒細(xì)胞成熟過程紊亂，這為理解Mir4435-2hg -/-小鼠中中性粒細(xì)胞的下降和 PMN-MDSCs 的升高提供了另一個視角。

大多數(shù)與膽固醇生物合成過程相關(guān)的上調(diào)基因（圖5B）和 GSEA 也表明這些基因富含膽固醇穩(wěn)態(tài)和脂肪酸代謝（圖 5C和D）。因為脂質(zhì)積累是 PMN-MDSCs 免疫抑制功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，作者推測較高的脂質(zhì)積累導(dǎo)致 PMN-MDSCs 在Mir4435-2hg -/-小鼠中的免疫抑制作用更強(qiáng)。通過 BODIPY 脂質(zhì)染色，作者觀察到來自無腫瘤Mir4435-2hg的中性粒細(xì)胞中脂質(zhì)積累的增加趨勢-/-小鼠，雖然差異不顯著。然而，來自攜帶腫瘤的Mir4435-2hg -/-小鼠脾臟的 PMN-MDSCs比 WT 小鼠具有更多的脂質(zhì)（圖 5E和F）。與此一致，體外由CT26和MC38誘導(dǎo)的Mir4435-2hg -/-小鼠BM衍生的PMN- MDSC具有比WT小鼠更多的脂質(zhì)（圖5G）。Mir4435-2hg -/-小鼠衍生的 PMN-MDSCs 表達(dá)更高的Arg1、Nos2、Cox2和 ROS（圖 5H-K)，對T細(xì)胞增殖有更強(qiáng)的抑制作用(圖5L)?？傊@些數(shù)據(jù)表明Mir4435-2hg的缺失增強(qiáng)了 PMN-MDSC 的免疫抑制能力。

圖5 Mir4435-2hg 的缺失增強(qiáng)了 PMN-MDSCs 的免疫抑制潛力

6. Mir4435-2hg的中性粒細(xì)胞特異性缺失促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展

為了進(jìn)一步證實中性粒細(xì)胞中Mir4435-2hg的消耗，而不是腸上皮細(xì)胞中的消耗，導(dǎo)致了在小鼠模型中觀察到的表型，作者生成了條件性敲除Mir4435-2hg flox/flox小鼠，并將它們與 S100a8-Cre 小鼠或 Villin-Cre 雜交小鼠構(gòu)建中性粒細(xì)胞或腸特異性Mir4435-2hg缺失小鼠（圖 6A）。外周血中白細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與Mir4435-2hg flox/flox 和 Mir4435-2hg flox/flox 相比，Mir4435-2hg flox / flox S100a8 -Cre 小鼠的中性粒細(xì)胞減少Villin-Cre 小鼠，嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量在Mir4435-2hg flox/flox S100a8-Cre 小鼠中也顯著減少。皮下腫瘤模型顯示，Mir4435-2hg flox/flox S100a8-Cre 小鼠的腫瘤生長速度明顯快于對照小鼠（圖 6B），并且在中性粒細(xì)胞缺陷型小鼠中腫瘤體積和重量（圖 6C和D）顯著增加Mir4435-2hg小鼠。與Mir4435-2hg -/-小鼠一致，作者發(fā)現(xiàn)來自攜帶腫瘤的Mir4435-2hg flox/flox S100a8-Cre 小鼠的 PMN-MDSCs 中有更高的脂質(zhì)積累（圖 6E），以及在體外由 MC38 培養(yǎng)基誘導(dǎo)的 BM 衍生的 PMN-MDSCs (圖 6F )。

在AOM/DSS模型中，Mir4435-2hg flox/flox S100a8-Cre 小鼠比Mir4435-2hg flox/flox Villin-Cre 和Mir4435-2hg flox/flox小鼠產(chǎn)生更多和更大的腫瘤（圖 6G） . 雖然Mir4435-2hg flox/flox S100a8-Cre 小鼠的腫瘤計數(shù)沒有顯著增加（圖 6H ），但Mir4435-2hg flox/flox S100a8的平均腫瘤大小和腫瘤負(fù)荷（圖 6I和J）顯著增加-Cre 老鼠。在Mir4435-2hg之間未觀察到腫瘤計數(shù)、腫瘤大小或腫瘤負(fù)荷的明顯變化flox/flox Villin-Cre 小鼠和Mir4435-2hg flox/flox小鼠。作者還觀察到，與Mir4435-2hg flox/flox Villin-Cre 小鼠和 Mir4435-2hg flox/flox 小鼠相比，Mir4435-2hg flox / flox S100a8 - Cre小鼠中更多的腫瘤浸潤性 PMN-MDSCs 和更少的 CD8 + T 細(xì)胞（圖 6K）。總體而言，中性粒細(xì)胞/PMN-MDSCs 中Mir4435-2hg的缺失促進(jìn)了結(jié)直腸癌的進(jìn)展，但腸上皮細(xì)胞中沒有。

圖6 中性粒細(xì)胞特異性Mir4435-2hg缺失促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展

結(jié)論：

該研究證明了MIR4435-2HG使用多個小鼠模型的意外作用。它通過重塑免疫微環(huán)境而不是作為腫瘤細(xì)胞中的癌基因發(fā)揮腫瘤基質(zhì)中的腫瘤抑制因子的作用。MIR4435-2HG的缺乏增加了腫瘤浸潤性PMN-MDSCs，增強(qiáng)了它們促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)展的免疫抑制潛力，進(jìn)一步闡明了結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制背后的機(jī)制，并提供了潛在的抗腫瘤免疫治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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