線粒體 交聯(lián) 鐵死亡 在心肌病中的作用
線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）系統(tǒng)缺陷引起的線粒體疾病的常見表型是心肌病和心衰。線粒體蛋白酶通過降解錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和平衡線粒體動(dòng)力學(xué)和線粒體自噬來控制線粒體的適應(yīng)性。線粒體內(nèi)膜（IM）蛋白酶Oma1在線粒體應(yīng)激時(shí)被激活，如線粒體去極化、氧化應(yīng)激、錯(cuò)誤折疊的IM蛋白質(zhì)積累、或熱應(yīng)激。本研究發(fā)現(xiàn)OMA1-DELE1介導(dǎo)的綜合應(yīng)急反應(yīng)（ISR）在線粒體心肌病中具有保護(hù)作用，并將鐵死亡與OXPHOS缺乏和線粒體疾病聯(lián)系起來。本研究于2022年9月發(fā)表在《Cell Metabolism》IF：31.373期刊上。
技術(shù)路線如下：
主要結(jié)果如下：
1、 Oma1缺失加重Cox10?/?小鼠擴(kuò)張型心肌病
為檢測(cè)Oma1在線粒體OXPHOS疾病中的作用，在肌酸激酶啟動(dòng)子(Ckmm-Cre)的控制下，用表達(dá)Cre重組酶的小鼠繁殖Cox10fl/fl和Oma1fl/fl，從骨骼肌和心肌中敲除Cox10和Oma1基因。如圖1A，心臟和骨骼肌中Cox10缺失導(dǎo)致小鼠早發(fā)擴(kuò)張型心肌病和死亡（中位年齡31天）。Cox10?/?小鼠表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩，骨骼肌量進(jìn)行性減少，心臟腫大，并伴有輕度結(jié)締組織積累（圖1B-E）。如預(yù)期的，觀察到COX亞基和組裝的COX復(fù)合體的水平急劇下降，心臟COX活性降低（圖1F-G） 。通過透射電子顯微鏡觀察到心肌組織的線粒體碎裂，線粒體超微結(jié)構(gòu)改變，線粒體腫大，嵴破裂（圖1H）。心臟中Cox10的缺失導(dǎo)致了Oma1的激活，表現(xiàn)為Opa1處理的增加和Opa1短形式c和e的積累（圖1I）。
此外，Oma1的缺失使Cox10-/-小鼠的心臟表型惡化，而單獨(dú)的Oma1-/-缺失沒有明顯影響。Cox10-/-Oma1-/-小鼠的壽命較短，中位生存期為 22 天（圖 1A），并且表現(xiàn)出更嚴(yán)重的心肌病和纖維化病變，表明細(xì)胞死亡（圖 1B-1E）。Cox10-/-小鼠中Oma1的缺失穩(wěn)定了長(zhǎng)Opa1形式并減少了線粒體碎片（圖1I）。然而，在缺乏Oma1的Cox10-/-心臟中，COX 亞基和組裝的COX復(fù)合物的積累沒有受到影響，嵴形態(tài)也沒有恢復(fù)（圖 1F-1H）。這些實(shí)驗(yàn)揭示Oma1在體內(nèi)OXPHOS 缺乏中的保護(hù)作用。
OXPHOS缺乏可通過多種機(jī)制損害各種小鼠組織和細(xì)胞模型的溶酶體功能。與此報(bào)道一致，在Cox10?/?心臟中觀察到含有線粒體和膜聚集物的大型溶酶體結(jié)構(gòu)（圖2A-C），并觀察到溶酶體標(biāo)記物L(fēng)amp1和自噬底物p62/SQSTM1（簡(jiǎn)稱p62）的積累（圖2D-E）。與Cox10?/?心臟相比，缺陷溶酶體結(jié)構(gòu)在Cox10-/-Oma1-/-心臟中進(jìn)一步積累，并且在Oma1缺失后Lamp1和p62的穩(wěn)態(tài)水平顯著增加（圖2F-G）。這些結(jié)果表明，在Cox10?/?缺陷的心肌細(xì)胞中，線粒體功能障礙導(dǎo)致溶酶體缺陷，且在缺少Oma1的情況下進(jìn)一步惡化。
由于觀察到pS6和p4E-BP1、mTORC1底物在Cox10?/?和Cox10-/-Oma1-/-心臟中積累（圖-2H-I），所以進(jìn)一步檢查了用雷帕霉素抑制mTORC1后是否會(huì)延長(zhǎng)小鼠的壽命。結(jié)果顯示雷帕霉素抑制Cox10?/?和Cox10-/-Oma1-/-心臟S6磷酸化（圖2H-I）。然而，用雷帕霉素喂養(yǎng)不影響小鼠的存活（圖2J）、線粒體超微結(jié)構(gòu)（圖 2K）、p62和Lamp1的積累（圖2H-I）。 因此，得出結(jié)論，增加mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)不會(huì)導(dǎo)致這些小鼠的溶酶體缺陷，并且Oma1通過另一種機(jī)制延長(zhǎng)Cox10?/?小鼠的壽命。
圖2 線粒體心肌病中Oma1缺失導(dǎo)致溶酶體缺陷和p62積累
3、Oma1激活Cox10?/?小鼠心臟的ISR
對(duì)4周大野生型、Cox10?/?、Oma1?/?、Cox10?/? Oma1?/?小鼠心臟組織進(jìn)行測(cè)序并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG分析。結(jié)果鑒定到Nrf2信號(hào)通路是Cox10?/?心臟中最顯著誘導(dǎo)的通路（圖3A）。根據(jù)靶基因表達(dá)，p53、Atf4和Nrf2是在Cox10?/?心臟中被預(yù)測(cè)為最顯著改變的轉(zhuǎn)錄因子（圖3B）。比較Cox10?/?和Cox10?/? Oma1?/?小鼠心臟的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)Atf4是變化最顯著的轉(zhuǎn)錄因子（圖3C）。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，作為ISR的一部分，Atf4和其它轉(zhuǎn)錄因子一起介導(dǎo)eIF2α信號(hào)通路可響應(yīng)不同的線粒體損傷。與Cox10?/? Oma1?/?心臟的ISR受損一致，在Cox10?/? Oma1?/?小鼠心臟中，Atf4靶基因Fgf21、Pycr1和Mthfd2的表達(dá)明顯低于Cox10?/?小鼠（圖3D）。對(duì)上述4種小鼠的TMT無偏蛋白組分析證實(shí)了以上發(fā)現(xiàn)（圖3E）。免疫印跡證實(shí)，與Cox10?/?心臟相比，Cox10?/? Oma1?/?心臟中Atf4和eIF2α磷酸化水平降低（圖3F-G）。綜上，在心臟OXPHOS缺乏的反應(yīng)中，Oma1是誘導(dǎo)Atf4介導(dǎo)ISR所必需的。
圖3 Cox10?/?小鼠心肌表現(xiàn)出Nrf2和p53激活以及Oma1和Dele1介導(dǎo)的Atf4信號(hào)通路
4、Cox10?/?小鼠中ISR誘導(dǎo)是Dele1依賴的
作者在此前的實(shí)驗(yàn)中為探究Oma1作用ISR激活的底物，比較了4種小鼠的線粒體蛋白組，分析發(fā)現(xiàn)Oma1促進(jìn)了Cox10?/?心臟中可能未組裝的COX亞基的蛋白水解，，其蛋白水解可能介導(dǎo)ISR激活，但沒有發(fā)現(xiàn)候選Oma1底物。雖然在心臟中表達(dá)，但作者通過質(zhì)譜沒有檢測(cè)到Dele1，Dele1已被確定為Oma1底物和Atf4依賴性線粒體應(yīng)激信號(hào)的關(guān)鍵成分。因此，構(gòu)建Dele1?/?小鼠，并將其與心臟和肌肉特異性Cox10?/?小鼠雜交，以研究Dele1在體內(nèi)對(duì)ISR信號(hào)的作用。敲除Dele1對(duì)小鼠的生存沒有廣泛影響，直到1歲時(shí)，在Dele1缺失的情況下，小鼠都沒有表現(xiàn)出任何擴(kuò)張表型，然而，當(dāng)同時(shí)缺失Cox10時(shí)，Dele1消融加重了Cox10?/?小鼠的表型，這些小鼠在約4周齡時(shí)死亡（圖4A）。與Cox10?/?小鼠相比，Cox10?/? Dele1?/?小鼠的體重進(jìn)一步降低，心臟/體重比進(jìn)一步增加，且心臟進(jìn)一步擴(kuò)張（圖4B-D），但不影響COX活性（圖4E）。在缺少Cox10的情況下，Dele1的缺失完全消除了Atf4和peIF2α的積累（圖4F-G），降低了ISR靶基因的表達(dá)（圖4H）。這些結(jié)果表明，Dele1的缺失與Oma1缺失類似同樣影響心臟特異性Cox10?/?小鼠的表型。ISR在Cox10?/?小鼠心臟中沿Oma1-Dele1軸被激活（圖4I），這與小鼠壽命延長(zhǎng)有關(guān)。
圖4 Cox10?/?小鼠心臟Dele1缺失惡化線粒體心肌病并損傷ISR
5、Oma1介導(dǎo)的ISR反應(yīng)支持心臟的谷胱甘肽代謝
為確定OXPHOS缺乏時(shí)ISR受損的代謝后果，在4種小鼠心臟中進(jìn)行靶向代謝組學(xué)研究（圖5A-B）。觀察到Cox10?/?心臟中單碳代謝中間體如絲氨酸、甘氨酸和蛋氨酸的積累，以及天冬酰胺、丙氨酸、支鏈氨基酸和脯氨酸的積累，Oma1的缺失沒有影響這些代謝物的穩(wěn)態(tài)水平，也沒有強(qiáng)烈影響它們?cè)贑ox10?/?心臟中的積累（圖5A）。完全相反，Cox10?/?心臟中GSH的還原形式的積累在Cox10?/?Oma1?/?心臟中顯著增加（圖5B），這表明Oma1在OXPHOS缺乏時(shí)調(diào)節(jié)GSH水平。GSH代謝與單碳代謝密切相關(guān)，由Atf4和Nrf2共同調(diào)控（圖5C）。與Oma1缺失時(shí)ISR受損一致，Cox10?/?心臟中參與GSH代謝的酶的表達(dá)增加，而與Cox10?/?心臟相比，Cox10?/?Oma1?/?心臟中幾種酶的表達(dá)顯著降低（圖5D）。蛋白質(zhì)組顯示，許多這些酶在 Cox10 缺陷的心臟中的積累和在沒有Oma1的情況下有較低的穩(wěn)態(tài)水平（圖5E）。這些蛋白質(zhì)包括GSH依賴的脂質(zhì)過氧化物酶Gpx4，GSH降解酶Chac1和Chop1，它們的積累通過對(duì)心臟組織的WB進(jìn)行監(jiān)測(cè)（圖5F-G）?？傊?，得出結(jié)論，Oma1介導(dǎo)的ISR支持Cox10?/?心臟中的GSH代謝。
圖5 Oma1介導(dǎo)的ISR支持線粒體心肌病的谷胱甘肽代謝
6、Cox10?/?Oma1?/?心臟具有鐵死亡特征
對(duì)心臟RNA-seq數(shù)據(jù)中與細(xì)胞死亡相關(guān)的基因進(jìn)行無監(jiān)督聚類，發(fā)現(xiàn)這些基因在Cox10?/?和Cox10?/?Oma1?/?心臟中有不同的調(diào)控，包括促凋亡蛋白Chop和Chac1（圖6A）。心臟切片的TUNEL染色檢測(cè)到Cox10?/?中TUNEL陽性心肌細(xì)胞比Cox10?/?Oma1?/?中更多（圖6B-C）。然而，檢測(cè)到的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量較少不能解釋Cox10?/?小鼠心肌病的嚴(yán)重程度，也不可能解釋Cox10?/?Oma1?/?小鼠的加重表型。此外，在Cox10?/?Oma1?/?心臟中存在炎癥反應(yīng)（圖6D）。結(jié)合該結(jié)果以及GSH和鐵死亡有關(guān)等，因而檢測(cè)了MDA的積累。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Cox10?/?中能檢測(cè)到MDA的積累但是在Cox10?/?Oma1?/?心臟中積累顯著增加（圖6E，H）。透射電子顯微鏡觀察到脂質(zhì)過氧化旋渦的形成（圖6F）。此外，染色也觀察到Cox10?/?Dele1?/?小鼠心臟中脂質(zhì)過氧化的形成。證實(shí)這種死亡與鐵死亡有關(guān)。此外，與Cox10?/?Oma1?/?小鼠相似（圖5E-5G），Cox10?/?心臟中Dele1的丟失使Gpx4蛋白水平降低到野生型水平（圖6J）。因此，Oma1或Dele1的缺失，消除 Cox10-/-心臟中的ISR，與Gpx4蛋白水平降低和脂質(zhì)過氧化增加有關(guān)，表明 Oma1-Dele1-Atf4 信號(hào)軸可防止OXPHOS缺陷心臟中的鐵死亡（圖6K）。
圖6 Cox10?/?小鼠心臟表現(xiàn)出Oma1依賴的鐵死亡特征和炎癥
7、依賴于Oma1的ISR在體外抵御鐵死亡
為明確ISR信號(hào)對(duì)鐵死亡的抵抗作用，分離4種小鼠的MEFs細(xì)胞。觀察到與WT、Cox10?/?、Oma1?/?細(xì)胞比較，Cox10?/?Oma1?/?細(xì)胞的存活率顯著下降（圖7A-B），但該情況在鐵死亡抑制劑Fer-1存在的情況下顯著抑制（圖7C），在鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin存在的情況下加?。▓D7D-E）。提示Oma1保護(hù)Cox10?/?MEFs細(xì)胞抵御鐵死亡。
與體內(nèi)結(jié)果類似，觀察到Atf4，GPX4，Chop在Cox10?/?而非Cox10?/?Oma1?/? MEFs細(xì)胞中積累（圖7F），同時(shí)，Atf4靶基因的Oma1依賴性表達(dá)增加，包括參與GSH代謝的各種酶（圖7G）。這些基因在Cox10?/?積累也依賴于Dele1（圖7H）。對(duì)這4種MEFs細(xì)胞的代謝組分析揭示了半胱氨酸、胱硫氨酸和谷胱甘肽在Cox10?/?而非Cox10?/?Oma1?/? MEFs細(xì)胞中積累（圖7I）。對(duì)Cox10?/?細(xì)胞施以eIF2α磷酸化和ISR信號(hào)通路抑制劑ISRIB處理。短時(shí)間用ISRIB處理增加野生型細(xì)胞對(duì)erastin的敏感性，而Cox10?/?的存活在這些條件下不受影響，在ISRIB長(zhǎng)時(shí)間抑制ISR后，erastin誘導(dǎo)的Cox10?/?細(xì)胞鐵死亡增加（圖7J）。同樣，Atf4或Dele1缺失增加了Cox10?/?細(xì)胞對(duì)erastin誘導(dǎo)的鐵死亡的易感性（圖7K）。這些證明Oma1-Dele1介導(dǎo)的ISR對(duì)鐵死亡有抵御作用。
此外，圖7L-M進(jìn)一步證明Oma1支持細(xì)胞對(duì)硒的利用并促進(jìn)Gpx4的積累。因此，Oma1介導(dǎo)的ISR增加了轉(zhuǎn)硫作用途徑酶的轉(zhuǎn)錄，從而支持硒的利用，從而促進(jìn)Gpx4的積累和對(duì)脂質(zhì)過氧化和鐵死亡的抵抗力（圖7N）。
圖7 ISR沿Oma1-Dele1-Atf4軸激活保護(hù)Cox10?/? MEFs抵抗鐵死亡
總之，如圖8所示，Cox10?/?心臟中的 OXPHOS 缺乏會(huì)導(dǎo)致心肌病并引發(fā)沿 Oma1-Dele1-Atf4 軸的綜合應(yīng)激反應(yīng)。Oma1依賴的應(yīng)激信號(hào)可保護(hù)谷胱甘肽代謝和Gpx4積累，以限制脂質(zhì)過氧化、抑制鐵死亡和延緩心肌病。
圖8 圖形摘要
參考文獻(xiàn)：
Ahola Sofia., Rivera Mejías Pablo., Hermans Steffen., Chandragiri Srikanth., Giavalisco Patrick., Nolte Hendrik., Langer Thomas.(2022). OMA1-mediated integrated stress response protects against ferroptosis in mitochondrial cardiomyopathy. Cell Metab, undefined (undefined), undefined. doi:10.1016/j.cmet.2022.08.017