鐵死亡抑制劑治療原發(fā)性卵巢功能不全
原發(fā)性卵巢功能不全（POI）是一種以原始卵泡過早衰竭為特征的卵巢功能障礙的臨床綜合征。POI能引起不孕不育、嚴重的日常生活紊亂和長期的健康風險。然而，POI的潛在機制在很大程度上仍不清楚。本文揭示了基于BNC1缺陷的POI的病理機制，提示YAP和鐵死亡抑制劑在POI治療中的潛在價值。本文于2022年10月發(fā)表在《Nature Communications》IF：17.694期刊上。
技術(shù)路線：
主要實驗結(jié)果：
1、Bnc1截斷突變導致卵泡過度激活和閉鎖
為確定Bnc1突變對卵泡發(fā)生的影響，從用10 IU孕母馬血清促性腺激素（PMSG）超排卵的4周齡和12周齡小鼠中收集生發(fā)囊（GV）卵母細胞，比較野生型（Bnc1tr/tr）和Bnc1純合子突變（WT，Bnc1+/+）的卵泡發(fā)生的變化。結(jié)果顯示與WT小鼠比較，Bnc1突變小鼠的卵母細胞增多，但卵巢反應(yīng)隨年齡的增加而下降（Fig. 1a–b）。作者猜想Bnc1tr/tr小鼠的卵巢儲備也隨著年齡的增長而下降。為驗證該猜想，比較WT和Bnc1tr/tr小鼠在出生后1天（PD1）和3, 4, 12, 16周時的卵泡數(shù)量。結(jié)果顯示，與WT比較，Bnc1tr/tr小鼠的卵泡數(shù)量在PD1時無差異（Fig. 1c），在3周時卵泡數(shù)量減少，卵泡過度激活，但未觀察到卵泡閉鎖（Fig. 1d），在4周時也是（Fig. 1e）。在12和16周時，表型和4周時類似，但是還觀察到閉鎖卵泡數(shù)量顯著增加，而原始卵泡耗竭率下降（Fig. 1f, g）。總之，這些數(shù)據(jù)表明，在具有Bnc1突變的小鼠POI模型中，卵泡過度激活（Fig. 1h-i），閉鎖卵泡數(shù)量隨著年齡的增長而增加。
2、條件敲除卵母細胞中Bnc1可通過卵泡過度激活和卵泡閉鎖誘導POI
采用Fig. 2a的方法構(gòu)建選擇性敲除卵母細胞Bnc1的小鼠，結(jié)果顯示Bnc1突變小鼠的卵巢重量/體重比和卵巢大小均小于WT小鼠（Fig. 2b），并且突變小鼠都不孕（Fig. 2c）；組織學和形態(tài)分析顯示Bnc1突變小鼠卵巢卵泡數(shù)量減少（Fig. 2d）；這種表型提示BNC1在卵母細胞中起作用，并在原始卵泡期起作用。此外，選擇性敲除卵母細胞Bnc1的小鼠的卵巢動態(tài)變化和Bnc1tr/tr小鼠的類似，其卵泡數(shù)量減少，卵泡過度激活和卵泡閉鎖（Fig. 2e-g）。這些數(shù)據(jù)表明，在卵母細胞特異性敲除Bnc1的小鼠中，卵泡被過度激活，閉鎖卵泡的數(shù)量增加。
圖2 Bnc1通過影響卵母細胞影響卵泡發(fā)育
3、Bnc1突變通過非凋亡性細胞死亡誘導卵泡閉鎖
由于文獻報道細胞凋亡參與了卵泡閉鎖，所以作者想確定細胞凋亡是否參與了Bnc1突變小鼠的卵巢卵泡閉鎖。然而，WB結(jié)果顯示W(wǎng)T和Bnc1tr/tr小鼠的卵巢中這些凋亡標志物的表達無差異（Fig. 3a-b）。Annexin V染色也顯示W(wǎng)T小鼠和卵母細胞特異性敲除Bnc1小鼠在早期的細胞凋亡方面無差異（Fig. 3c）。類似地，DNA損傷標志物也在兩種小鼠間無差異（Fig. 3d）。這些結(jié)果表明Bnc1突變小鼠的卵泡閉鎖不是通過由凋亡介導而是通過非凋亡細胞死亡通路實現(xiàn)的。
4、異常的脂質(zhì)代謝和鐵死亡參與卵泡閉鎖
為揭示Bnc1突變導致卵泡閉鎖的分子機制，對卵巢組織進行RNA測序，總計獲得523個差異表達基因（Fig. 4a）。KEGG和GSVA揭示相比于WT小鼠，突變小鼠的卵巢表現(xiàn)出脂質(zhì)代謝紊亂（Fig. 4b, c）。此外，卵母細胞Smart-seq獲得了類似的結(jié)果，總計收獲4554個差異表達基因（Fig. 4d, e），GO分析提示他們參與異常的線粒體功能和脂質(zhì)代謝受損（Fig. 4f, g），KEGG顯示它們參與Hippo和鐵死亡通路（Fig. 4h, i）。鑒于線粒體介導的脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的關(guān)鍵，所以這些結(jié)果提示鐵死亡可能參與Bnc1突變導致的POI進展。
圖4 Bnc1突變可能通過鐵死亡誘導卵泡閉鎖
為表征Bnc1突變是否導致卵母細胞鐵死亡，采用透射電鏡和掃描電鏡觀察突變小鼠的GV卵母細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bnc1突變導致過多的脂質(zhì)積累（Fig. 5a）；線粒體分布異常，聚集異常；線粒體膜的密度增加（Fig. 5b）；GV卵母細胞和小鼠卵巢的尼羅紅染色也證實了脂質(zhì)積累（Fig. 5c）。此外，選擇性敲除卵母細胞Bnc1的小鼠和Bnc1tr/tr小鼠的卵母細胞中ROS和MitoSOX的水平均顯著增加（Fig. 5d, e），且在卵母細胞中發(fā)現(xiàn)線粒體分布缺陷，線粒體位于細胞膜下方（Fig. 5e）。JC-1染色顯示兩種突變鼠卵母細胞中的線粒體膜電位明顯升高（Fig. 5f）。兩種突變鼠卵母細胞中的脂質(zhì)ROS產(chǎn)量也顯著增加（Fig. 5g），而GPX4的表達顯著下降（Fig. 5h, i），Nox1和Cox2的表達增加，其余鐵死亡標志物的表達也異常改變（Fig. 5j）。進一步研究發(fā)現(xiàn)。鐵死亡誘導劑RLS3和抑制劑Fer-1可分別顯著增強或抑制Bnc1缺陷誘導的小鼠卵母細胞脂質(zhì)過氧化（Fig. 5k）。綜上所述，這些結(jié)果表明，卵母細胞的Bnc1突變和敲除可誘導鐵死亡。
圖5受Bnc1突變影響的卵母細胞對鐵死亡更加敏感
6、BNC1缺乏通過NF2-YAP途徑引發(fā)卵母細胞鐵死亡
為探究Bnc1缺失誘導卵母細胞鐵死亡的分子機制，進行了ChIP-seq，發(fā)現(xiàn)NF2可能是Bnc1的靶基因。據(jù)文獻報道敲除NF2和激活Hippo可促進鐵死亡。所以作者探究了Bnc1缺失是否通過調(diào)控NF2誘導卵母細胞鐵死亡。ChIP-qPCR和雙熒光素酶實驗都證實了Bnc1可與NF2的啟動子區(qū)域結(jié)合（Fig. 6a, b）。此外，啟動子缺失試驗確定片段（1-500 bp）是Bnc1調(diào)控Nf2所需的（Fig. 6b）。免疫熒光和免疫組化結(jié)果顯示，相比于WT小鼠卵巢，Bnc1tr/tr小鼠的卵母細胞中NF2的表達顯著下降，YAP的核定位及下游基因TFRC和ACSL4的表達顯著增加（Fig. 6c-g）；Fe2+含量顯著增加（Fig. 6h）。過量鐵依賴的PUFA的過氧化可誘導鐵死亡。靶向脂質(zhì)組學揭示相比于WT小鼠，Bnc1突變小鼠卵母細胞中PUFA組分的水平顯著增加，如(PE) (18:1/18:2)，PE (16:0/20:4)，PE (18:2/18:2)，PE (18:1/20:4)，(PS) (14:0/20:4)和(PI)(18:0/18:2)（Fig. 6i）。這些結(jié)果表明，Bnc1靶向NF2介導Hippo-YAP通路，參與鐵死亡的調(diào)控。
圖6 Bnc1截斷突變通過調(diào)節(jié)NF2-YAP信號使卵母細胞對鐵死亡敏感
7、靶向NF2-Hippo/YAP通路挽救Bnc1突變誘導的鐵死亡
為進一步探究Bnc1通過調(diào)控NF2介導鐵死亡的分子機制，將Nf2 mRNA微注射到GV卵母細胞中，然后檢測NF2和活化的YAP的水平。結(jié)果顯示補充Nf2 mRNA后Bnc1tr/tr小鼠卵母細胞中NF2的表達顯著增加，而核YAP的水平顯著減少（Fig. 7a）。然后檢測了YAP特異性抑制劑VP靶向YAP的效果。結(jié)果顯示，與Bnc1tr/tr小鼠比較，注射VP的Bnc1tr/tr小鼠的原始卵泡的數(shù)量增加，過度激活
的卵泡減少（Fig. 7b），TFRC和COX2的表達下降（Fig. 7c, d），F(xiàn)e2+含量顯著下降（Fig. 7e），脂質(zhì)過氧化下降（Fig. 7f）。以上結(jié)果表明靶向NF2-Hippo/YAP通路可挽救Bnc1突變誘導的鐵死亡。
圖7靶向NF2-Hippo/YAP信號通路挽救Bnc1突變誘導的鐵死亡
最后作者探究了鐵死亡抑制劑Fer-1對小鼠POI的藥理改善作用。結(jié)果如圖8所示，與Bnc1tr/tr小鼠比較，F(xiàn)er-1處理的Bnc1tr/tr小鼠的卵巢重量增加，卵巢/體重比升高（Fig. 8a, b），閉鎖卵泡數(shù)量無顯著變化（Fig. 8c），紊亂發(fā)情周期的持續(xù)時間縮短（Fig. 8d），脂質(zhì)過氧化水平下降（Fig. 8e），GPX4表達升高和COX2表達升高（Fig. 8f）。這些結(jié)果表明Fer-1阻斷鐵死亡可改善Bnc1缺失引起的POI。
圖8 Fer-1可部分改善Bnc1截斷突變的POI表型
總之，BNC1直接調(diào)控Nf2的表達。BNC1缺失下調(diào)NF2表達，降低YAP磷酸化，促進YAP核積累。YAP的激活上調(diào)了Tfrc和Acsl4的表達，隨之而來的是鐵的吸收增加和脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生增強，最終導致卵母細胞鐵死亡（圖9）。
圖9 BNC1-Merlin-Hippo-YAP signaling-Ferroptosis信號軸示意圖。
參考文獻：
Wang Feixia., Liu Yifeng., Ni Feida., Jin Jiani., Wu Yiqing., Huang Yun., Ye Xiaohang., Shen Xilin., Ying Yue., Chen Jianhua., Chen Ruixue., Zhang Yanye., Sun Xiao., Wang Siwen., Xu Xiao., Chen Chuan., Guo Jiansheng., Zhang Dan.(2022). BNC1 deficiency-triggered ferroptosis through the NF2-YAP pathway induces primary ovarian insufficiency. Nat Commun, 13(1), 5871. doi:10.1038/s41467-022-33323-8