胃癌(GC)是全球第五大最常見的惡性腫瘤和第三大癌癥相關(guān)死亡原因,每年約有40% 的新病例和死亡發(fā)生在中國。化療仍然是晚期GC治療的基石。然而,耐藥性和不可避免的嚴重毒性導致化療失敗。因此,迫切需要闡明更詳細的分子機制并確定GC治療的有效治療靶點。該研究發(fā)表于《ADVANCED SCIENCE》,IF: 17.521。
技術(shù)路線:
主要研究結(jié)果:
1. ABL在GC中上調(diào)并預(yù)測GC患者的預(yù)后不良
為了分析GC中的lncRNAs表達,作者首先通過RNA測序(RNA-seq)分析了來自GC患者的四對癌性和匹配的相鄰正常組織標本。代表性上調(diào)和下調(diào)的lncRNA(倍數(shù)變化>2或 <1/2,p值<0.05)顯示在熱圖中(圖1A)。有趣的是,兩個名為RP3-512B11.3(ABL)和 LOC730102的lncRNA被確定為進一步研究的熱門(圖1B)。接下來,作者利用癌癥基因組圖譜(TCGA)和生物信息學工具GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)的數(shù)據(jù)分析了選定的 lncRNA表達與GC預(yù)后之間的關(guān)聯(lián),結(jié)果顯示GC患者ABL 表達較高的結(jié)果較差(p=0.024),而LOC730102表達與GC預(yù)后無顯著相關(guān)性(p=0.61)。因此,選擇lncRNA ABL作為進一步研究的候選者。
使用5'- 和3'- cDNA末端快速擴增 (RACE) 測定法來確定ABL的整個序列,確認在BGC-823細胞中檢測到的序列與存檔的ABL轉(zhuǎn)錄本(ENST00000561592)相同UCSC數(shù)據(jù)庫(http ://genome.ucsc.edu/)。隨后,通過qRT-PCR測定ABL在GC組織中的表達,表明與配對的相鄰正常組織相比,癌性GC組織中ABL表達顯著上調(diào)(圖1C)。進行了RNAscope和RNA熒光原位雜交(RNA-FISH)測定,證實了與GC組織中配對的正常胃粘膜細胞相比,GC細胞中ABL的顯著豐度(圖1D, E)。為了進一步研究ABL在GC中表達的臨床相關(guān)性,作者使用隊列1的組織微陣列進行了RNA-FISH測定,結(jié)果表明ABL在癌性GC組織中的表達遠高于匹配的正常胃組織(n=81,p=0.024;圖1F, G)。此外,Kaplan-Meier分析表明,ABL表達較高的GC患者總生存期降低(n=81,p=0.02968,對數(shù)秩檢驗;圖1H)。多變量Cox回歸分析表明ABL表達是GC患者預(yù)后的獨立預(yù)測標志物(圖1M)。為了進一步評估ABL表達的預(yù)測價值,作者進行了時間相關(guān)的受試者工作特征曲線分析。在隊列1中,臨床風險評分(TNM分期)和ABL風險評分的組合比單獨的評分更準確(圖1I)。例如,臨床風險評分在第5年的曲線下面積(AUC)為0.712,而臨床風險評分和ABL風險評分的組合顯著增加至0.889。此外,隊列1中的這些結(jié)果也得到了具有更多GC患者的獨立隊列(隊列2,n=192)的支持,這表明ABL表達在預(yù)后不良的GC患者中顯著增加(圖1J,K)。此外,單變量/多變量Cox回歸分析還顯示,T、N和M類別以及ABL表達與GC患者的生存率顯著相關(guān)(圖1N)。AUC還表明,在隊列2中,TNM分期和ABL風險評分的組合比單獨的評分更準確(圖1L)??傊?,這些數(shù)據(jù)表明ABL表達在GC中顯著增加,并且ABL可能是GC患者的獨立預(yù)后因素。
圖1 ABL表達升高與GC患者的不良預(yù)后相關(guān)
2. ABL通過其WD1/WD2域直接綁定到APAF1
為了闡明ABL在GC中的功能作用,作者首先檢查了它的亞細胞定位。RNA-FISH分析顯示ABL主要位于細胞質(zhì)中(圖2A)。為了鑒定ABL的蛋白質(zhì)伙伴,體外轉(zhuǎn)錄的生物素化ABL有義和反義轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過lncRNA pull-down和質(zhì)譜(MS)分析。值得注意的是,有義ABL轉(zhuǎn)錄本與APAF1特異性相關(guān)(圖2B)。然后,用細胞裂解物和RNA免疫沉淀(RIP)分析進行的RNA pull-down分析進一步證實了ABL與APAF1的特定關(guān)聯(lián)(圖2C, D)。此外,RNA-FISH結(jié)合免疫熒光(IF)顯示ABL和APAF1的細胞質(zhì)共定位模式(圖2E)。為了確定負責APAF1結(jié)合的ABL序列基序,作者進行了體外RNA下拉,然后進行了如前所述的斑點印跡分析。由APAF1結(jié)合的ABL的基序序列被鑒定為包含nt 481-540(圖2F)。此外,使用重組APAF1進行的體外RNA蛋白結(jié)合試驗也證實ABL可以直接與APAF1相互作用,但ABL中相應(yīng)序列(nt 481-540)的缺失完全消除了其與APAF1的相互作用(圖2G)。此外,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域作圖分析表明,ABL與APAF1 C末端氨基酸(aa) 613-1248的區(qū)域結(jié)合,包含15個WD40重復,構(gòu)成兩個β-螺旋槳,分別稱為WD1 (aa 613-910)和WD2 (aa 922–1248) (圖2H,I)。WD40結(jié)構(gòu)域是一個非經(jīng)典的 RNA 結(jié)合基序,這與作者發(fā)現(xiàn)APAF1的 WD1/WD2 結(jié)構(gòu)域作為ABL的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是一致的。有趣的是,RNA-蛋白質(zhì)對接分析還顯示,使用PDB2PQR服務(wù)器,ABL的nt 481-540區(qū)域與APAF1的WD1/WD2結(jié)構(gòu)域完美相互作用(圖2J)?;谶@些結(jié)果,作者推測APAF1可能是一種RNA結(jié)合蛋白(RBP),作者接下來進行了互補DNA末端的線性擴增和測序(LACE-seq)以證實這一假設(shè)。LACE-seq 鑒定的APAF1結(jié)合位點映射到2493個轉(zhuǎn)錄本(4662個結(jié)合峰),分布在編碼序列(CDS)、基因間區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、非編碼RNA(ncRNA)、3' 非翻譯區(qū)(UTR), 和5' UTR (圖2K)。此外,作者發(fā)現(xiàn)APAF1在轉(zhuǎn)錄起始位點 (TSS) 周圍顯示出豐富的結(jié)合(圖2L)。同時,通過Multiple Em for Motif Elimination tool (MEME)分析APAF1結(jié)合基序(圖2M),并且“AACCUU_AG”共義序列可以映射到ABL轉(zhuǎn)錄本的481-540 nt中,與APAF1的 WD1/WD2 結(jié)構(gòu)域相互作用。然后RIP-qPCR測定證實APAF1可以與LACE-seq中鑒定的mRNA或lncRNA顯著相互作用。其中,ABL比其他RNA更豐富(圖2N)??偟膩碚f,這些結(jié)果表明ABL可以作為潛在的RBP直接與APAF1相互作用。
圖2 ABL直接與APAF1結(jié)合
3. ABL促進GC細胞存活并抑制多種藥物誘導的細胞凋亡
APAF1對內(nèi)在途徑介導的細胞死亡至關(guān)重要,細胞死亡是由發(fā)育譜系信息、癌基因激活、DNA損傷和營養(yǎng)缺乏誘導的,并與化學抗性有關(guān)。因此,作者推測ABL通過與APAF1 結(jié)合來調(diào)節(jié)這一過程。首先,作者生成了穩(wěn)定的ABL敲低和ABL過表達的GC細胞(圖3A)。此外,ABL的敲低明顯抑制了超低附著培養(yǎng)板中GC細胞的生長,而ABL的上調(diào)則促進了細胞生長(圖3B,C)。然后,集落形成試驗表明,與相應(yīng)的對照細胞的集落數(shù)相比,ABL缺陷細胞的集落數(shù)顯著減少,但ABL過表達細胞的集落數(shù)增加(圖3D-G)。此外,當細胞用指定劑量的順鉑 (DDP) 處理時,ABL缺陷細胞的集落數(shù)比對照細胞的集落數(shù)顯著減少(圖3D, E)。相反,與順鉑處理后的對照細胞相比,ABL過表達細胞的集落數(shù)顯著增加(圖3F, G)。作者進一步評估了ABL與5-Fu和PTX治療的這種效果。結(jié)果還支持以下結(jié)論:ABL的敲低加速了5-Fu和PTX誘導的細胞凋亡,而ABL的過表達促進了有或沒有5-Fu或PTX處理的細胞存活(圖3H-K)??傊?,這些數(shù)據(jù)表明ABL促進GC細胞存活并可能參與多藥耐藥性。
圖3 ABL的敲低促進GC細胞凋亡和體外對多種藥物的敏感性
4. ABL通過競爭性阻斷Cyt c與APAF1的相互作用來拮抗GC細胞凋亡
為了進一步表征ABL調(diào)節(jié)細胞凋亡和化學抗性的機制,作者首先檢測了參與內(nèi)在凋亡途徑的關(guān)鍵分子的蛋白質(zhì)水平。ABL的上調(diào)降低了順鉑誘導的cleaved caspase-9/3的表達,但ABL的敲低增加了這種表達(圖4A)。然而,APAF1和Cyt c的蛋白水平?jīng)]有受到明顯影響(圖4A)??紤]到Cyt c夾在APAF1的WD1和WD2的兩個正面之間,這也是ABL結(jié)合域,作者詢問ABL與APAF1的結(jié)合是否競爭性地阻止了Cyt c與APAF1的相互作用。事實上,在用順鉑處理過的ABL過表達GC細胞中,APAF1與Cyt c結(jié)合的能力被顯著抑制(圖4B)。此外,作者發(fā)現(xiàn)與對照細胞相比,用順鉑處理的ABL過表達細胞中APAF1和Cyt c的共定位減少了(圖4C)。此外,ABL 的過表達顯著抑制順鉑誘導的caspase-9活化(圖4D)。有趣的是,ABL-APAF1結(jié)構(gòu)對接分析還表明,ABL中包括nt 481-540的區(qū)域,尤其是482 GAACC 486基序,與APAF1的WD2結(jié)構(gòu)域中的Leu1089/Gly1178和WD1結(jié)構(gòu)域中的Trp884非常接近(圖4E),它們也是通過冷凍電子顯微鏡確定的APAF1-Cyt c相互作用的特定殘基。接下來,為了進一步確定ABL是否可以阻斷Cyt c與APAF1的結(jié)合,體外轉(zhuǎn)錄的ABL有義、反義和突變有義(ΔAPAF1,APAF1 結(jié)合位點的缺失,nt 481-540)轉(zhuǎn)錄物是與純化的APAF1-WD1/WD2結(jié)構(gòu)域和Cyt c蛋白一起孵育,結(jié)果表明,在存在ABL正義的情況下,與APAF1的WD1/WD2結(jié)構(gòu)域結(jié)合的Cyt c的量急劇下降,但沒有ABL反義或突變正義(ΔAPAF1) (圖4F)??傊?,這些數(shù)據(jù)表明ABL競爭性地抑制Cyt c與APAF1的相互作用,從而削弱caspase-9的激活。
隨后,作者檢查了ABL是否以依賴于nt 481-540核心區(qū)域的方式拮抗GC凋亡。構(gòu)建了表達野生型ABL(WT)或突變型ABL(缺失nt481-540, Mut)的質(zhì)粒。Annexin-V-FITC/PI染色分析結(jié)果表明,與對照表達相比,過表達ABL-WT而不是ABL-Mut可減少順鉑誘導的細胞凋亡(圖4G, H)。檢測凋亡細胞的TUNEL試驗也證實了該結(jié)果(圖4I, J)。
圖4 ABL通過競爭性阻斷APAF1與Cyt c的結(jié)合來拮抗GC細胞凋亡
為了進一步研究ABL在藥物誘導的細胞凋亡中的作用,作者還建立了GC類器官模型。當用順鉑或PTX處理類器官時,與相應(yīng)的對照類器官相比,ABL上調(diào)的類器官顯示出順鉑/PTX誘導的細胞凋亡顯著減少(圖5A)。Cleaved caspase-3染色還表明,與對照組相比,ABL過表達組的凋亡細胞數(shù)量顯著減少(圖5B)。然后,作者進行了腫瘤異種移植研究,以驗證ABL在體內(nèi)GC生長和順鉑敏感性中的作用。結(jié)果表明,過表達ABL可以促進腫瘤生長,過表達組與對照組相比,腫瘤的大小和重量證明了這一點(圖5C-E)。此外,ABL的過表達顯著拮抗順鉑的抗腫瘤作用(圖5C-E)。與對照組相比,ABL過表達組的ABL表達顯著增加(圖5F)。此外,免疫組織化學(IHC)結(jié)果顯示,與接受或不接受順鉑治療的對照組相比,ABL過表達組的腫瘤組織中Ki-67(一種增殖標志物)的表達增加(圖5G)。最后,cleaved caspase-3染色和TUNEL測定顯示,與順鉑處理后的對照組相比,ABL過表達組的凋亡細胞數(shù)量顯著減少(圖5G)。這些結(jié)果表明ABL通過競爭性阻斷Cyt c與APAF1的結(jié)合來拮抗藥物誘導的細胞凋亡。
圖5 ABL在體內(nèi)促進GC細胞生長和多藥耐藥性
5. IGF2BP1結(jié)合并識別ABL上METTL3介導的m6A修飾,保持ABL穩(wěn)定性
為了探索ABL在GC中高表達的機制,作者首先使用UCSC基因組瀏覽器(http://genome.ucsc.edu/) 分析了ABL啟動子區(qū)域的表觀遺傳修飾。在ABL的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了高度富集的H3K27乙?;℉3K27ac)信號,表明ABL表達可能被染色質(zhì)乙?;せ?。已知H3K27ac被P300/CBP復合物催化。然而,使用兩種特異性siRNA敲除P300并不能調(diào)節(jié)ABL的水平。因此,作者推測其他機制調(diào)節(jié)ABL的表達。
m6A甲基化已被確定為在mRNA和非編碼RNA中普遍存在的最豐富的修飾,可影響RNA的穩(wěn)定性、剪接、定位和翻譯。最近的研究報告說,IGF2BPs,包括 IGF2BP1/2/3,是一個獨特的m6A閱讀器家族,其靶向數(shù)千個RNA以增強RNA穩(wěn)定性。作者之前的研究還表明,IGF2BP3依賴性m6A修飾可維持HDGF mRNA的穩(wěn)定性。作者首先使用兩個特異性siRNA敲低IGF2BP1和IGF2BP3。只有敲低 IGF2BP1顯著抑制ABL表達,而敲低IGF2BP3 沒有明顯效果(圖6A)。此外,RNA pull-down和RIP檢測證實了ABL與IGF2BP1的相互作用(圖6B, C)。IF測定還表明,細胞質(zhì)ABL與IGF2BP1共定位(圖6D)。此外,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域作圖分析顯示ABL特異性結(jié)合IGF2BP1的KH1/2結(jié)構(gòu)域(圖6E, F)。作者還發(fā)現(xiàn)由 IGF2BP1結(jié)合/保護的ABL基序序列被鑒定為包含 nt 121-180(圖6G)。ABL中該序列(nt 121-180)的缺失完全消除了其與重組IGF2BP1的直接相互作用,而ABL中APAF1結(jié)合序列(nt 481-540)的缺失不影響這種結(jié)合(圖6H)。先前的一項研究表明,IGF2BP1/3優(yōu)先與富含CA的序列相互作用,并且IGF2BPs也可以識別關(guān)鍵的m6A基序GGAC。令人驚訝的是,作者發(fā)現(xiàn)ABL的核心序列(nt 121-180)含有“122 GGACCACA 129”基序,暗示IGF2BP1可能直接與“CACA”基序結(jié)合,進而識別m6A基序“GGAC”ABL(圖6I)。為了進一步驗證ABL的121-180 nt區(qū)域中的“GGAC”基序被m6A修飾,作者將腺苷(A)替換為胞嘧啶(C),并插入了帶有野生型的ABL的部分121-180 nt序列或?qū)6A位點突變?yōu)闊晒馑孛笀蟾尜|(zhì)粒(圖6J),這表明IGF2BP1在ABL-WT組中引起相對熒光素酶活性的上調(diào),但在ABL-Mut組中沒有(圖6K)。此外,RNA-蛋白質(zhì)對接分析還表明,ABL的“GGACCACA”序列在與IGF2BP1的KH1/2結(jié)構(gòu)域中的幾個殘基結(jié)合中起重要作用(圖6L)。
為進一步探索m6A對ABL調(diào)控的影響,作者構(gòu)建了表達野生型METTL3或其催化突變體(aa395-398,DPPW→APPA)的質(zhì)粒。結(jié)果表明,在METTL3過表達細胞中ABL的表達增加,而催化突變體METTL3過表達不能促進ABL表達(圖6M)。同時,METTL3的敲低降低了ABL的水平(圖6N)。MeRIP-qPCR數(shù)據(jù)還顯示,m6A特異性抗體在廣泛型METTL3過表達后顯著富集ABL;然而,與對照細胞相比,它在催化突變METTL3過表達細胞中沒有明顯效果(圖6O)。有趣的是,作者通過RIP-qPCR分析發(fā)現(xiàn)IGF2BP1可以在METTL3過表達時富集更多的ABL(圖6P),表明ABL上的m6A修飾促進了其與IGF2BP1的結(jié)合。隨后,作者探討了IGF2BP1對ABL穩(wěn)定性的影響。GC細胞用放線菌素D(一種轉(zhuǎn)錄抑制劑)處理指定的時間。ABL水平在METTL3過表達時顯示出高度穩(wěn)定,而在IGF2BP1敲低時觀察到相反的效果(圖6Q,R)。
為了進一步表征IGF2BP1-ABL軸在GC細胞存活和耐藥性中的致癌功能,進行了集落形成測定。METTL3的過表達顯著促進了GC細胞存活并抵消了順鉑誘導的細胞凋亡,但使用特異性siRNA敲低METTL3過表達的GC細胞中的ABL顯著抑制了這些作用(圖6S, T)。此外,在順鉑處理后,IGF2BP1或METTL3的敲低增加了切割的caspase-3表達和APAF1與Cyt c結(jié)合的能力(圖6U)。因此,作者的數(shù)據(jù)表明IGF2BP1結(jié)合并識別METTL3介導的ABL上的m6A修飾,并穩(wěn)定ABL轉(zhuǎn)錄物,這可能導致多藥耐藥性。
圖6 IGF2BP1結(jié)合并識別METTL3介導的m6A對ABL的修改,保持ABL的穩(wěn)定性
6. 脂質(zhì)體介導的ABL特異性siRNA和PTX的協(xié)同遞送協(xié)同誘導體內(nèi)GC細胞凋亡
為了研究ABL作為GC治療靶點的潛在價值,作者開發(fā)了載有ABL特異性siRNA的聚(乙二醇)修飾的陽離子脂質(zhì)體(PEG-CLs)。陰離子ABL特異性siRNA (si-ABL) 首先由陽離子魚精蛋白縮合,形成的siRNA/魚精蛋白復合物進一步包裹在負載PTX的陽離子脂質(zhì)體中(圖7A)。siRNA/魚精蛋白復合物的N:P比為4:1,總脂質(zhì)量為100 nmol μg -1 (脂質(zhì)/siRNA)。優(yōu)化的si-ABL和PTX共載PEG-CLs (si-ABL+PTX/PEG-CLs),PEG與總脂質(zhì)的摩爾比為 5%,平均直徑為73.12±1.92 nm,zeta電位為0.172±0.609 mV(圖7B)。
此外,作者使用異種移植小鼠模型評估了si-ABL+PTX/PEG-CLs的體內(nèi)抗腫瘤功效。在指定時間通過尾靜脈將不同的脂質(zhì)體制劑注射到模型小鼠中(圖7C)。結(jié)果表明,與PBS 或si-Ctrl/ PEG-CLs(圖7D-F)。在所有組中,si-ABL+PTX/PEG-CL組顯示出最高的抗腫瘤能力(圖7D-F)。此外,通過RNA-FISH分析證實,在si-ABL/PEG-CL和si-ABL+PTX/PEG-CL 組中ABL的表達顯著降低(圖7G)。作者還發(fā)現(xiàn),在單獨使用si-ABL/PEG-CLs、PTX/PEG-CLs 或 si-Ctrl+PTX/PEG-CLs處理的小鼠中,凋亡細胞數(shù)量顯著增加,而Ki-67陽性細胞數(shù)量減少,并且這種效果在si-ABL+PTX/PEG-CL 組中比在PBS或si-Ctrl/PEG-CL 組中更明顯(圖7G),表明si-ABL和PTX的協(xié)同抗腫瘤能力。
圖7 納米封裝的ABL特異性siRNA和PTX在體內(nèi)協(xié)同誘導GC細胞凋亡
結(jié)論:
該研究結(jié)果揭示了lncRNA ABL在GC中的抗凋亡作用,這與GC細胞存活和化療藥物耐藥性相關(guān),導致GC患者預(yù)后不良。此外,使用納米封裝的siRNA結(jié)合化療藥物靶向ABL可能代表了一種新的GC治療策略。因此,ABL可能是GC的潛在預(yù)測因子和治療靶點。
參考文獻:
Wang Q, Chen C, Xu X, Shu C, Cao C, Wang Z, et al. APAF1-Binding Long Noncoding RNA Promotes Tumor Growth and Multidrug Resistance in Gastric Cancer by Blocking Apoptosome Assembly. Adv Sci (Weinh). 2022 Oct;9(28):e2201889. doi: 10.1002/advs.202201889.