發(fā)現(xiàn)病毒性心肌炎新靶點的途徑——酶切割炎癥小體

心肌炎的治療方案目前有限。抑制鈣激活酶已被證明可以預防CVB3誘導的心臟損傷，但鈣激活酶的潛在作用機制尚未闡明。本研究證明CVB3感染誘導鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1在線粒體中積累，并導致隨后的ATP5A1裂解、線粒體ROS過量產生和線粒體功能受損，最終引起NLRP3炎癥小體活化并誘導細胞焦亡。本發(fā)現(xiàn)確立calpain在病毒性心肌炎中的作用，并揭示其潛在的作用機制。因此，calpain有望成為治療病毒性心肌炎的新靶點。

技術路線：

主要研究結果：

1、MCC950抑制CVB3誘導的凋亡和炎癥反應，保護心肌功能

作者首先探討直接抑制NLRP3炎癥小體在心肌炎中的作用。在柯薩奇病毒B3（CVB3）感染前給予NLRP3選擇性抑制劑MCC950后，NLRP3、Gasdermin D N端結構域（Gasdermin D-NT）和cleaved caspase-1（c-caspase-1）蛋白水平降低（圖1A）。與CVB3單獨感染小鼠相比，MCC950和CVB3共同感染小鼠心臟組織中c-caspase-1的免疫熒光密度降低，與WB結果一致（圖1B）。重要的是，給予MCC950后，NLRP3與ASC的共定位明顯被抑制，提示NLRP3炎癥小體的平臺形成減少（圖1C）。ELISA檢測細胞焦亡情況，結果顯示CVB3刺激后血清CK-MB、LDH、cTnI、IL-18、IL-18β水平升高，而MCC950處理后可逆轉上述效應（圖1D-H）。此外，CVB3感染誘導的CD4陽性T淋巴細胞和F4/80陽性巨噬細胞浸潤在CVB3 + MCC950組中不明顯（圖1I）。此外，與CVB3組相比，CVB3 + MCC950組通過降低射血分數(shù)（EF）和短軸縮短率（FS）顯著改善心功能（圖1J）。此外，CVB3 + MCC950組的心肌細胞存活率高于CVB3組，表明MCC950介導的抑制NLRP3炎癥小體活化減輕CVB3誘導的死亡（圖1K）。因此，MCC950能抑制CVB3誘導的凋亡和炎癥反應，保護心肌功能。

圖1 腹腔注射CVB3建立小鼠心肌炎模型

2、Calpastatin過表達抑制CVB3誘導的細胞凋亡、纖維化和炎癥，改善心功能障礙

接下來揭示calpain在CVB3誘導的心肌炎中潛在作用機制。如圖2A所示，在CVB3注射后第7天，WT + CVB3組145/150 kDa處的α-Fodrin顯著增加，而Tg-CAST + CVB3組α-Fodrin顯著減少，提示calpastatin過表達對calpain活化的抑制作用。TUNEL染色顯示WT + CVB3組TUNEL陽性細胞數(shù)較Tg-CAST + CVB3組增多（圖2B）。HE染色結果顯示，與WT + CVB3組相比，calpastatin過表達抑制CVB3誘導的炎癥反應，Tg-CAST + CVB3組可見較少的炎性細胞浸潤和壞死灶（圖2C）。與WT小鼠相比，CVB3感染后Tg-CAST小鼠心臟組織中CD4 + T淋巴細胞和F4/80 +巨噬細胞浸潤減少（圖2D）。這說明長期CVB3感染導致心臟纖維化和心功能障礙。心臟組織切片的Masson染色顯示，CVB3感染后100個月，WT小鼠心臟纖維化顯著增加，而Tg-CAST小鼠心臟纖維化無明顯變化（圖2E）。CVB3感染導致WT小鼠出現(xiàn)明顯的心功能障礙，表現(xiàn)為左心室EF和FS降低，而過表達calpastatin的Tg-CAST小鼠心功能顯著改善（圖2F）。因此，在體內抑制calpain不僅在急性期保護小鼠心臟免受CVB3感染誘導的細胞凋亡和炎癥反應，而且在長期保護小鼠心臟免受心臟纖維化和心功能障礙。

圖2 在calpastatin過表達小鼠（Tg-CAST）及其同窩野生型小鼠（WT）中構建CVB3誘導的心肌炎模型

3、calpastatin過表達抑制CVB3感染后NLRP3炎癥小體和細胞焦亡

接下來，作者確定calpain是否在NLRP3炎癥小體的激活中發(fā)揮作用。在CVB3感染后，與WT小鼠相比，Tg-CAST小鼠的NLRP3、gasdermin D-NT和c-caspase-1水平顯著降低（圖3A）。免疫熒光染色也顯示，在Tg CAST + CVB3組中過表達calpastatin抑制c-caspase-1、ASC、NLRP3的表達以及ASC與NLRP3的共定位（圖3B-C）。此外，Tg-CAST + CVB3組血清CK-MB、LDH、cTnI、IL-18和IL-1 β水平較低，表明細胞焦亡較少（圖3D-H）。為驗證在體內的發(fā)現(xiàn)，并確定鈣離子依賴的中性蛋白酶-I1是否是CVB3誘導的心肌炎中的主要鈣蛋白酶，用鈣離子依賴的中性蛋白酶-I1選擇性抑制劑PD151746處理乳鼠心肌細胞后降低145/150 kDa處α-Fodrin的水平，證實鈣激活酶的激活被PD151746顯著抑制（圖3I）。此外，PD151746處理抑制CVB3感染后心肌細胞中NLRP3、Gasdermin D-NT和c-caspase-1水平升高（圖3I）。此外，PD151746保護心肌細胞免受CVB3誘導的細胞死亡（圖3J）。這些發(fā)現(xiàn)證實鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1是CVB3誘導的心肌炎中主要的鈣蛋白酶?？傊w內和體外實驗的結果提示，在CVB3感染的環(huán)境中抑制鈣激活酶的激活可以阻斷NLRP3炎癥小體的激活，抑制細胞焦亡。

圖3 CVB3感染的Tg-CAST和WT小鼠NLRP3炎癥小體活化和細胞焦亡

4、mito-TEMPO預防炎癥，抑制NLRP3炎癥小體，改善心臟功能

下面進一步研究CVB3對病毒心肌組織發(fā)育過程中線粒體功能的影響。HE染色顯示，CVB3感染后第3天，幾乎看不到浸潤的炎性細胞和壞死灶，但在CVB3感染后第7天，心肌出現(xiàn)嚴重的心臟炎癥和損傷（圖4A）。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，CVB3感染后第3天開始出現(xiàn)線粒體形態(tài)的改變。線粒體腫脹，排列不規(guī)則，內含不規(guī)則排列的嵴，嵴異常，空泡增多（圖4A）。因此，在炎癥反應之前出現(xiàn)異常線粒體，表明線粒體功能障礙可能導致CVB3誘導的心肌炎炎癥。在CVB3感染前腹腔注射線粒體靶向抗氧化劑（mito-TEMPO）的小鼠，可降低CVB3誘導的線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平（圖4B）。CVB3感染誘導的CD4陽性T淋巴細胞和F4/80陽性巨噬細胞的浸潤也被mito-TEMPO阻斷（圖4C）。重要的是，mito-TEMPO改善心臟功能，表現(xiàn)為增強的EF值和FS值（圖4D）。線粒體ROS能否作為NLRP3炎癥小體激活的原因。mito-TEMPO處理不僅降低CVB3誘導的Gasdermin D-NT和c-caspase-1水平的升高（圖4E），而且降低血清CK-MB、LDH、IL-18和IL-1 β水平的升高（圖4F-J）。總之，這些結果表明在CVB3誘導的心肌炎中，線粒體ROS與NLRP3炎癥小體活化之間存在關聯(lián)。

圖4 mito-TEMPO預防炎癥，抑制NLRP3炎癥小體，改善心臟功能

5、Calpain-1調節(jié)線粒體功能，mito-TEMPO逆轉calpain-1介導的NLRP3炎癥小體活化

作者檢測calpain在CVB3誘導的心肌炎中線粒體功能障礙與炎癥反應中的作用。透射電鏡顯示，第3天起，與WT + CVB3組相比，過表達calpastatin的Tg-CAST + CVB3組線粒體結構損傷減輕，線粒體排列整齊，嵴排列較規(guī)則，空泡較少（圖5A）。此外，如圖所示，CVB3感染顯著降低心肌ATP生成，而calpastatin過表達逆轉受損的ATP生成，盡管并不顯著（圖5B）。此外，與WT + CVB3組相比，Tg-CAST + CVB3組心臟ROS染色不明顯（圖5C）。以上結果提示體內抑制calpain活性時線粒體功能更好。此外，JC-1染色檢測線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，Δψm）結果顯示CVB3感染導致Δψm降低，表現(xiàn)為較高的綠/紅熒光比值，而PD151746單獨處理并不影響Δψm，但PD151746處理可以阻止CVB3感染時Δψm的丟失（圖5D）。此外，CVB3感染降低心肌細胞ATP生成，但PD151746處理在CVB3感染時一定程度上保留ATP生成（圖5E）。接下來，作者使用MitoSOX Red探針檢測線粒體氧化應激。如圖5F所示，CVB3增加心肌細胞線粒體ROS生成，PD151746可抑制CVB3誘導的線粒體ROS生成。為直接地檢測Calapin-1在心肌細胞中的作用，用帶有Flag標簽的過表達鈣離子依賴的中性蛋白酶-I腺病毒（Ad-CAPN1）感染原代心肌細胞。Ad-CAPN1顯著上調Flag表達，表明具有較高的感染效率（圖5G）。心肌細胞用Ad-CAPN1或對照腺病毒（Ad-CT）處理48 h后感染CVB3，或Ad-CT感染的心肌細胞用CVB3和PD151746處理，然后用XFe96細胞外流量分析儀測定耗氧率（OCR）。CVB3處理下線粒體的基礎呼吸、ATP連接的呼吸和最大呼吸均受到抑制，而鈣離子依賴的中性蛋白酶-I1過表達并感染Ad-CAPN1進一步加劇這些效應。相反，PD151746緩解CVB3損傷的線粒體呼吸（圖5H-K）。此外，鈣離子依賴的中性蛋白酶-I1過表達加重CVB3誘導的細胞死亡，而mito-TEMPO保留細胞活性（圖5L）。同樣，CVB3處理后，mito-TEMPO孵育后鈣離子依賴的中性蛋白酶-I1過表達增強的Gasdermin D-NT和c-caspase-1蛋白水平降低（圖5M）。綜上所述，鈣離子依賴的中性蛋白酶-I1通過線粒體ROS介導的NLRP3炎癥小體活化調節(jié)CVB3處理下的線粒體功能。

圖5 calpain-1調節(jié)線粒體功能，mito-TEMPO逆轉calpain-1介導的NLRP3炎癥小體活化

6、CVB3刺激后calpain?1在線粒體中積累

鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1在心肌細胞中的具體作用靶點尚不清楚，作者評估CVB3感染下鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1在心肌細胞中的胞漿和線粒體定位。在心臟組織中分離胞漿和線粒體組分，然后檢測鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1的蛋白水平。GAPDH的缺失和VDAC1的富集證實線粒體的純度，CVB3感染的心臟中線粒體鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1與胞漿鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1的比值顯著升高（圖6A）。與體內研究結果一致，免疫熒光染色顯示CVB3感染促進體外培養(yǎng)的心肌細胞中鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1與線粒體的共定位（圖6B），且CVB3感染后鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1在線粒體中的蛋白水平高于細胞質（圖6C）。因此，在CVB3感染下，細胞內鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1的重新分布可能有助于其作用的發(fā)揮。然后，鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1過表達僅限于線粒體（圖6D）。在線粒體中過表達鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1導致AC16細胞活力降低，該作用可被mito-TEMPO阻斷（圖6E）。此外，過表達線粒體鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1增加gasdermin D-NT和c-caspase-1的蛋白水平，而mito-TEMPO抑制gasdermin D-NT和c-caspase-1的蛋白水平（圖6F）?？傊?，數(shù)據(jù)表明CVB3刺激后鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1的細胞質到線粒體的轉位負責其對細胞活力和NLRP3炎癥小體活化的調節(jié)。

圖6 CVB3刺激后Calpain-1在線粒體中積累

7、ATP5A1是鈣蛋白酶-1的切割靶點

為進一步探索CVB3感染下鈣離子依賴的中性蛋白酶-I-1在心肌細胞中的直接作用靶點，作者用Ad-CAPN1在新生大鼠心肌細胞中過表達calpain-1，然后在CVB3感染或不感染的情況下，將提取的蛋白與抗Flag抗體或對照抗IgG抗體進行免疫共沉淀并進行質譜分析。篩選出假陽性蛋白，即抗Flag抗體免疫沉淀的蛋白與相應對照的重疊蛋白，在Ad-CAPN1感染的細胞中，有8個蛋白被抗Flag抗體免疫沉淀，有或沒有CVB3處理（圖7A）。因此，作者檢測WT + CVB3組和Tg-CAST + CVB3組中ATP synthase-α（ATP5A1）的表達。研究發(fā)現(xiàn)CVB3感染降低WT小鼠ATP5A1的表達，但在Tg-CAST小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)（圖7B），這表明CVB3感染激活的calpain可能切割ATP5A1，導致功能性ATP5A1蛋白水平降低。體外實驗結果也顯示CVB3感染降低ATP5A1水平，而PD151746共處理逆轉的這一現(xiàn)象（圖7C）。此外，CVB3處理NRCMs后，在抗鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1抗體免疫沉淀樣品中檢測到ATP5A1的表達，在抗ATP5A1抗體免疫沉淀樣品中檢測到鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1的表達，OV07 1與NRCMs中的ATP5A1存在相互作用（圖7D-E）。將siATP5A1轉染NRCMs敲低ATP5A1表達（圖7I），JC-1染色和MitoSOX染色發(fā)現(xiàn)siATP5A1降低線粒體Δψm，增加線粒體ROS（圖7F）。ATP5A1下調也降低ATP的生成（圖7G）。此外，與對照siRNA相比，siATP5A1降低NRCMs的活力（圖7H），促進NLRP3炎癥小體的激活，表現(xiàn)為gasdermin D-NT和c-caspase-1的水平升高（圖7I）。因此，ATP5A1是鈣蛋白酶-1的切割靶點。

圖7 ATP5A1是鈣蛋白酶-1的切割靶點

結論

在本研究中，作者證明體內外抑制calpain通過抑制NLRP3炎癥小體的激活減輕CVB3誘導的心肌損傷。此外，作者發(fā)現(xiàn)CVB3處理下鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1的作用改變線粒體功能，因為鈣離子依賴的中性蛋白酶-I 1易位到線粒體并切割ATP5A1，導致ATP合成不足，線粒體ROS過量產生，線粒體功能障礙，隨后激活NLRP3炎癥小體和細胞焦亡（圖8）。

圖8在CVB3刺激下激活的Calpain-1通過線粒體中ATP5A1的裂解和ROS的過量產生促進NLRP3炎性體依賴性的焦亡

參考文獻

Liu X, Li M, Chen Z, Yu Y, Shi H, Yu Y, Wang Y, Chen R, Ge J. 2022. Mitochondrial calpain-1 activates NLRP3 inflammasome by cleaving ATP5A1 and inducing mitochondrial ROS in CVB3-induced myocarditis. Basic Res Cardiol; 117(1):40. doi: 10.1007/s00395-022-00948-1.