乳酸-NAD+軸通過下調(diào)p62激活腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞

p62水平降低與癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)表型的誘導(dǎo)相關(guān)，CAF表型通過炎癥和代謝重編程在體內(nèi)外促進(jìn)腫瘤發(fā)生。然而，腫瘤細(xì)胞如何下調(diào)基質(zhì)成纖維細(xì)胞中的p62來驅(qū)動(dòng)CAF激活是該領(lǐng)域尚未解決的核心問題。近日，有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤分泌的乳酸下調(diào)了間質(zhì)成纖維細(xì)胞中的p62；乳酸降低NAD+水平和PARP-1活性，從而下調(diào)間質(zhì)p62；AP-1對(duì)乳酸誘導(dǎo)的間質(zhì)成纖維細(xì)胞p62損失至關(guān)重要；PARP-1抑制劑(奧拉帕利)通過p62促進(jìn)間質(zhì)成纖維細(xì)胞的結(jié)締組織反應(yīng)。該研究探究了癌細(xì)胞促進(jìn)前致瘤性CAF表型的分子機(jī)制，為抑制CAF活性提供新的治療策略。該研究于2022年5月發(fā)表在《CELL REPORTS》，IF：9.995。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 前列腺癌細(xì)胞分泌一種可溶性因子，可降低基質(zhì)成纖維細(xì)胞中p62的表達(dá)

為了研究p62在腫瘤間質(zhì)中表達(dá)下調(diào)的機(jī)制，作者建立了小鼠GFP標(biāo)記的前列腺基質(zhì)細(xì)胞(mPSCs)與TRAMPC2前列腺癌(PCa)上皮細(xì)胞混合的體外細(xì)胞系統(tǒng)。與腫瘤細(xì)胞孵育時(shí)，基質(zhì)細(xì)胞中Sqstm1(編碼p62) mRNA水平降低，這也與真正CAF標(biāo)志物(如Tgfb1和Sdf-1)的增加相關(guān)(圖1A)。為了驗(yàn)證p62的下調(diào)是否需要腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的細(xì)胞接觸，將人前列腺基質(zhì)成纖維細(xì)胞(WPMY-1)與不同的PCa細(xì)胞系在雙腔環(huán)境中共培養(yǎng)。在這些條件下，基質(zhì)細(xì)胞中p62的蛋白和mRNA水平也下調(diào)(圖1B和圖1C)，表明由PCa上皮細(xì)胞分泌的可溶性因子足以下調(diào)基質(zhì)細(xì)胞中的p62。來自PCa細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM)孵育基質(zhì)細(xì)胞有效降低了基質(zhì)細(xì)胞中的p62蛋白和mRNA水平，而正常前列腺上皮細(xì)胞(PrEC或RWEP1)的CM沒有任何影響(圖1D和1E)。為了確定SQSTM1 mRNA的減少是否是由于轉(zhuǎn)錄活性的抑制，使用了SQSTM1啟動(dòng)子控制下的熒光素酶報(bào)告基因。PCa CM降低了熒光素酶報(bào)告的活性(圖1F)，表明基質(zhì)p62的下調(diào)是通過腫瘤細(xì)胞分泌的可溶性因子抑制SQSTM1啟動(dòng)子介導(dǎo)的。為了鑒定這種假定的腫瘤來源的可溶性因子，對(duì)PC3細(xì)胞的CM進(jìn)行了大小分級(jí)。在成纖維細(xì)胞中，未分割的腫瘤CM和<3-kDa片段均在蛋白和mRNA水平上下調(diào)p62(圖1G和1H)，以及SQSTM1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因的活性(圖1I)。然而，>3-kDa部分在這些試驗(yàn)中完全不活躍(圖1G-1I)?；钚钥扇苄砸蜃泳哂袩岱€(wěn)定性(圖1J-1L)，提示其可能為代謝物。

圖1 PCa細(xì)胞分泌一種可溶性因子，可降低基質(zhì)細(xì)胞中p62的表達(dá)

2. 乳酸下調(diào)間質(zhì)成纖維細(xì)胞中的p62

由于癌細(xì)胞分泌大量的乳酸，并且由于Warburg效應(yīng)在TME中積累，推測(cè)乳酸可能是導(dǎo)致p62下調(diào)的代謝物。正如預(yù)期的那樣，PCa細(xì)胞系分泌的乳酸量高于正常前列腺上皮細(xì)胞(圖2A)。由于乳酸的細(xì)胞攝取是由不同的單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MCT1、MCT2、MCT3和MCT4)介導(dǎo)的，接下來測(cè)試了阻斷這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否可以損害乳酸誘導(dǎo)的p62下調(diào)。MCT1在WPMY-1細(xì)胞中控制乳酸的細(xì)胞輸入，敲低MCT1導(dǎo)致PC3細(xì)胞的CM誘導(dǎo)的p62下調(diào)受到抑制(圖2B-2D)。同樣，當(dāng)PC3細(xì)胞中控制乳酸輸出的MCT4被敲低時(shí)，WPMY-1細(xì)胞中p62的下調(diào)也被消除(圖2E-2G和S1B)。MCT1抑制劑AZD3965處理PC3 CM處理的WPMY-1細(xì)胞后，p62下調(diào)受損(圖2H-2J)。這些結(jié)果表明，PCa細(xì)胞分泌乳酸和基質(zhì)細(xì)胞攝取乳酸是基質(zhì)p62下調(diào)的關(guān)鍵步驟。為了證明乳酸足以下調(diào)成纖維細(xì)胞中的p62，將WPMY-1細(xì)胞與不同濃度的乳酸孵育24或48小時(shí)，這導(dǎo)致p62以時(shí)間和劑量依賴的方式下調(diào)(圖2K-2N)。在基質(zhì)細(xì)胞中下調(diào)p62所需的乳酸量(圖2M和2N)與PCa細(xì)胞分泌的乳酸量(圖2A)相似，也與體內(nèi)腫瘤的乳酸量相似。然而，簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基酸化不足以下調(diào)p62(圖2O)。這些結(jié)果表明，上皮PCa細(xì)胞分泌的乳酸在轉(zhuǎn)錄水平上損害了基質(zhì)細(xì)胞中p62的表達(dá)。

圖2 乳酸下調(diào)p62

3. AP-1通過乳酸抑制p62下調(diào)

為了闡明乳酸下調(diào)基質(zhì)p62的機(jī)制，下一步通過轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測(cè)序全基因組分析(ATAC-seq)研究了乳酸處理的成纖維細(xì)胞的染色質(zhì)可及性。這項(xiàng)分析顯示，在乳酸處理的細(xì)胞中，染色質(zhì)可及性普遍降低(圖3A)。HOMER(基序富集的超幾何優(yōu)化)分析表明，在乳酸處理的細(xì)胞的封閉染色質(zhì)區(qū)域中，AP-1轉(zhuǎn)錄因子顯著富集(圖3B)。對(duì)SQSTM1啟動(dòng)子的分析表明存在三個(gè)AP-1調(diào)節(jié)位點(diǎn)，這些位點(diǎn)也表明在乳酸處理的條件下染色質(zhì)可及性降低(圖3C)。與此一致，乳酸抑制了AP-1驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因(圖3D)，這共同表明SQSTM1啟動(dòng)子中AP-1位點(diǎn)的抑制可以解釋乳酸對(duì)基質(zhì)p62表達(dá)的影響。

為了確定AP-1位點(diǎn)在SQSTM1啟動(dòng)子中的作用，分別突變了這些位點(diǎn)(AP-1A, AP-1B和AP-1C)，并確定這些突變對(duì)SQSTM1啟動(dòng)子活性的影響。AP-1A的突變使SQSTM1啟動(dòng)子完全失活，達(dá)到與乳酸產(chǎn)生的水平相當(dāng)?shù)乃剑鳤P-1B或AP-1C的突變沒有影響(圖3E)，這表明AP-1A是SQSTM1啟動(dòng)子中介導(dǎo)乳酸抑制的關(guān)鍵增強(qiáng)子元件。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，通過CRISPR-Cas9編輯選擇性地刪除內(nèi)源性SQSTM1啟動(dòng)子中的AP-1A元件，從而產(chǎn)生4種獨(dú)立的WPMY-1細(xì)胞培養(yǎng)物(sgAP-1A)，這導(dǎo)致p62 mRNA和蛋白表達(dá)受到抑制(圖3F-3H)。這些結(jié)果確立了AP-1A在基質(zhì)細(xì)胞中調(diào)節(jié)p62表達(dá)的相關(guān)性。與這一觀點(diǎn)一致， ChIP分析表明，乳酸顯著減少了c-FOS和c-JUN募集到AP-1A調(diào)節(jié)位點(diǎn)，但沒有減少FOSB或JUNB的募集，且未檢測(cè)到與AP-1B或AP-1C位點(diǎn)的結(jié)合發(fā)生變化(圖3I)。下調(diào)c-FOS、c-JUN和JNK，或者用JNK的兩種藥理抑制劑抑制c-JUN磷酸化，在蛋白和mRNA水平上模擬了乳酸對(duì)p62表達(dá)的影響(圖3J-3M)。這些數(shù)據(jù)表明，c-JUN/c-FOS AP-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物募集受損在乳酸誘導(dǎo)的基質(zhì)p62下調(diào)中起關(guān)鍵作用。

圖3 AP-1通過乳酸抑制p62的下調(diào)

4. 乳酸代謝降低NAD+水平介導(dǎo)p62下調(diào)

研究成纖維細(xì)胞中細(xì)胞外乳酸的命運(yùn)。應(yīng)用2H和13C同位素示蹤和質(zhì)譜方法來量化細(xì)胞外乳酸對(duì)NADH和中心碳代謝的貢獻(xiàn)。細(xì)胞外乳酸通過LDH活性代謝，將氫原子貢獻(xiàn)到NADH池并再生胞質(zhì)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)池(圖4A和4B)。接下來，發(fā)現(xiàn)大約20%的[13C]乳酸示蹤劑在三羧酸(TCA)循環(huán)中間產(chǎn)物上，這表明細(xì)胞外乳酸被代謝為促進(jìn)線粒體TCA循環(huán)代謝的碳源(圖4A和圖4C)。測(cè)定在10 mM外源[13C]乳酸存在下的乳酸攝取和分泌通量的實(shí)驗(yàn)表明，WPMY-1細(xì)胞在分泌未標(biāo)記的乳酸的同時(shí)攝取標(biāo)記的乳酸(圖4A和圖4D)。這些結(jié)果與以下事實(shí)一致：乳酸可以可逆性地轉(zhuǎn)化為丙酮酸鹽，隨后NAD+水平減少，有利于NADH的生成。增加培養(yǎng)基中丙酮酸的水平，使這一反應(yīng)向相反的方向發(fā)生，顯然損害了乳酸下調(diào)p62的能力(圖4E和圖4F)。因此，NAD+/NADH比率的變化可能有助于乳酸調(diào)節(jié)p62水平的作用機(jī)制。與這一假設(shè)一致，乳酸處理的基質(zhì)成纖維細(xì)胞中的NAD+水平低于未處理的細(xì)胞(圖4G)。使用NAD+或NAD+前體煙酰胺核苷(NR)治療完全挽救了乳酸誘導(dǎo)的p62減少，且獨(dú)立于自噬(圖4H-4K)。

圖4 乳酸改變NAD+/NADH水平介導(dǎo)p62下調(diào)

5. 乳酸抑制PARP-1可下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞p62

NAD+是三種轉(zhuǎn)錄和翻譯后調(diào)節(jié)因子的輔因子，包括sirtuins (SIRT1到SIRT7)、cyclic ADP-核糖合酶(CD38和CD157)和PARPs (PARP-1/2)。其中，只有PARP-1的敲低或CRISPR-Cas9缺失完全模擬了乳酸對(duì)p62表達(dá)的影響(圖5A -5E)。此外，PARP-1抑制劑PJ34或奧拉帕利也以劑量依賴性方式降低了p62的表達(dá)(圖5F-5I)。PARP-1除了在DNA損傷修復(fù)(DNA damage repair, DDR)中發(fā)揮眾所周知的作用外，還控制許多其他的生物過程，包括轉(zhuǎn)錄。此外，奧拉帕利抑制了c-FOS和c-JUN向SQSTM1啟動(dòng)子中AP-1A結(jié)合位點(diǎn)的募集(圖5J和圖5K)。這些結(jié)果表明，基質(zhì)細(xì)胞中乳酸代謝觸發(fā)的NAD+水平的變化對(duì)PARP-1活性的調(diào)節(jié)是p62下調(diào)的工具。因此，我們假設(shè)乳酸可以影響PARP-1的活化，從而影響c-JUN和c-FOS的聚腺苷二磷酸核糖基化。乳酸處理的細(xì)胞總poly(ADP-ribosyl)ation水平降低，c-JUN和c-FOS的poly(ADP-ribosyl)ation受損(圖5L-5N)。在乳酸處理的細(xì)胞中添加NAD+可恢復(fù)這兩種轉(zhuǎn)錄因子的poly(ADP-ribosyl)ation (圖5O和5P)，以及它們向SQSTM1啟動(dòng)子中AP-1調(diào)節(jié)位點(diǎn)的募集(圖5Q和5R)。這些數(shù)據(jù)表明，乳酸代謝導(dǎo)致的NAD+耗損以及隨后c-FOS和c-JUN的poly(ADP-ribosyl)ation受損是乳酸下調(diào)基質(zhì)成纖維細(xì)胞中p62的機(jī)制基礎(chǔ)。

圖5 抑制PARP-1可下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞p62水平

6. AP-1在p62缺失驅(qū)動(dòng)的CAF激活中至關(guān)重要

p62缺失可驅(qū)動(dòng)基質(zhì)細(xì)胞中的CAF表型，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。由于PCa細(xì)胞的乳酸分泌對(duì)于下調(diào)基質(zhì)中的p62是必要和充分的，因此下一步確定乳酸是否驅(qū)動(dòng)CAF表型。乳酸處理成纖維細(xì)胞增加了CAF活化的真正標(biāo)志物的表達(dá)，如ACTA2和TGF-β，這些標(biāo)志物的表達(dá)被添加NAD+逆轉(zhuǎn)(圖6A和6B)。對(duì)乳酸處理的細(xì)胞中差異表達(dá)基因的基因集富集分析(GSEA)顯示，來自人類基質(zhì)PCa數(shù)據(jù)集(GEO: GSE34312)的CAF signatures富集(圖6C)。此外，SQSTM1啟動(dòng)子內(nèi)源性失活的sgAP-1A成纖維細(xì)胞也顯示出CAF標(biāo)志物表達(dá)增加(圖6D)。同樣，在雙腔共培養(yǎng)系統(tǒng)中，成纖維細(xì)胞sgAP-1A促進(jìn)PC3細(xì)胞的遷移和侵襲，而sgC沒有作用(圖6E-6G)。PC3細(xì)胞與sgC和sgAP-1A成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)表明，與sgC細(xì)胞相比，sgAP-1A細(xì)胞增強(qiáng)了PCa上皮細(xì)胞的侵襲和增殖指數(shù)(圖6H和6I)。此外，與sgC成纖維細(xì)胞共植入相比，PC3細(xì)胞與sgAP-1A成纖維細(xì)胞共植入皮下異種移植導(dǎo)致腫瘤生長增加(圖6J-6L)。由sgAP-1A成纖維細(xì)胞生成的腫瘤顯示基質(zhì)活化標(biāo)志物增加，如膠原沉積、透明質(zhì)酸(HA)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)(圖6M)。這些結(jié)果證實(shí)SQSTM1啟動(dòng)子中的AP-1調(diào)節(jié)位點(diǎn)是乳酸驅(qū)動(dòng)信號(hào)的靶點(diǎn)，并且在基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性p62水平的控制中具有關(guān)鍵作用，對(duì)CAF表型的誘導(dǎo)至關(guān)重要。

圖6 AP-1控制基質(zhì)細(xì)胞中SQSTM1啟動(dòng)子對(duì)PCa腫瘤的生長和侵襲至關(guān)重要

7. PARP-1抑制劑通過p62促進(jìn)間質(zhì)成纖維細(xì)胞的結(jié)締組織反應(yīng)

根據(jù)作者的模型，乳酸通過抑制PARP-1觸發(fā)基質(zhì)成纖維細(xì)胞中p62的下調(diào)。同樣，通過CRISPR-Cas9敲除PARP-1模擬了乳酸的作用，并誘導(dǎo)了ACTA2和TGF-β等CAF活化標(biāo)志物(圖7A)。因此，假設(shè)PARP-1抑制劑(如奧拉帕利)足以誘導(dǎo)基質(zhì)激活。奧拉帕利降低了SQSTM1 mRNA，并上調(diào)了ACTA2、SFRP1、TGF-β、MMP9和HA合酶等CAF標(biāo)志物(圖7B)。此外，對(duì)奧拉帕利處理的細(xì)胞進(jìn)行的ATAC-seq分析表明，與乳酸處理相似，整個(gè)基因組中，在AP-1轉(zhuǎn)錄因子(包括SQSTM1啟動(dòng)子)的共有基序區(qū)域，染色質(zhì)可及性顯著降低(圖7C)。PC3細(xì)胞與奧拉帕利預(yù)處理的WPMY-1細(xì)胞共培養(yǎng)導(dǎo)致PCa細(xì)胞在基礎(chǔ)條件下的遷移和侵襲增加，這一情況在雄激素剝奪(ADT)下更為明顯(圖7D-7F)。此外，奧拉帕利處理的WPMY-1 CM導(dǎo)致PC3增殖增加(圖7G和7H)。根據(jù)這些觀察結(jié)果，假設(shè)奧拉帕利治療后基質(zhì)激活可能會(huì)抑制其抗腫瘤活性。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，在基礎(chǔ)或ADT條件下將GFP標(biāo)記的PC3細(xì)胞(PC3GFP)與WPMY-1細(xì)胞(共培養(yǎng))或不與WPMY-1細(xì)胞(單獨(dú)培養(yǎng))共培養(yǎng)，并且使用或不使用奧拉帕利治療10日(圖7I)。與單獨(dú)培養(yǎng)條件下的處理相比，與WPMY-1細(xì)胞共培養(yǎng)使PC3GFP細(xì)胞對(duì)奧拉帕利具有更高的耐藥性(圖7J)。這一效應(yīng)在ADT條件下更加明顯(圖7J)。為了研究奧拉帕利的體內(nèi)前CAF表型，下一步在NOD scid γ (NSG)小鼠中共植入PC3和WPMY-1細(xì)胞，并使用溶劑或奧拉帕利對(duì)它們進(jìn)行處理(圖7K)。體內(nèi)奧拉帕利治療有效降低了腫瘤生長(圖7L-7M)，但也產(chǎn)生了強(qiáng)烈的促結(jié)締組織增生反應(yīng)，其特征是膠原和HA沉積增強(qiáng)以及αSMA增加(圖7N)。在內(nèi)源性TRAMP小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了類似的奧拉帕利誘導(dǎo)的促結(jié)締組織增生性應(yīng)答(圖7O和7P)。為了檢驗(yàn)這些發(fā)現(xiàn)與人類的相關(guān)性，將分析擴(kuò)展到兩個(gè)人類PCa異種移植物(VCAP和H660)和之前報(bào)告的對(duì)奧拉帕利治療有應(yīng)答的PDX模型。與小鼠數(shù)據(jù)一致，奧拉帕利在所有人類PCa模型中均誘導(dǎo)了強(qiáng)基質(zhì)激活(圖S6F)。

圖7 奧拉帕尼治療模擬p62的乳酸損失，促進(jìn)基質(zhì)激活

總結(jié)

腫瘤細(xì)胞分泌的乳酸在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)p62，從而誘導(dǎo)基質(zhì)激活。乳酸導(dǎo)致NAD+/NADH比值降低，從而損害poly(ADP-ribose)polymerase 1 (PARP-1)活性。臨床上使用的PARP-1抑制劑(如奧拉帕利)在下調(diào)p62和促進(jìn)CAF活性方面模擬了乳酸的作用，這一事實(shí)揭示了基于PARP-1抑制劑的療法的一個(gè)出乎意料的潛在弱點(diǎn)，并提示奧拉帕利與抗基質(zhì)靶向療法的聯(lián)合治療將提高奧拉帕利的療效。