外泌體circLPAR1通過(guò)與METTL3-eIF3h相互作用調(diào)節(jié)BRD4水平抑制結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生

外泌體是癌癥的重要生物標(biāo)志物，含有豐富的環(huán)狀RNAs (circRNAs)。然而，外泌體circRNAs在結(jié)直腸癌(CRC)中的作用分子機(jī)制尚不清楚。circLPAR1被包裹在外泌體中，具有較高的穩(wěn)定性，在CRC發(fā)生過(guò)程中，circLPAR1在血漿外泌體中的表達(dá)明顯降低，但術(shù)后恢復(fù)。外泌體circLPAR1與生物標(biāo)志物CEA和CA19-9聯(lián)合分析，在CRC診斷中具有癌癥特異性。此外，circLPAR1在CRC組織中下調(diào)，并與總生存率相關(guān)。機(jī)制上，外泌體circLPAR1被CRC細(xì)胞內(nèi)化，并抑制腫瘤生長(zhǎng)，可能是因?yàn)橥饷隗wcircLPAR1直接與eIF3h結(jié)合，特異性地抑制了METTL3-eIF3h相互作用，減少了癌基因BRD4的翻譯。這項(xiàng)綜合研究強(qiáng)調(diào)了血漿外泌體circLPAR1作為CRC診斷的一個(gè)有前景的預(yù)測(cè)因子，并描述了其在結(jié)直腸癌發(fā)生中的生物學(xué)調(diào)節(jié)。本研究為疾病發(fā)展的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。本文于2022年2月發(fā)表于Molecular Cancer (IF=41.444)上。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

(1) 下調(diào)的circLPAR1在結(jié)直腸癌中被包裹在外泌體中

為了描述結(jié)直腸癌中失調(diào)的circRNAs，我們對(duì)52對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤和NATs進(jìn)行了RNA-Seq，觀察到14221個(gè)circRNAs且其中大多數(shù)小于500 nt(圖1A-B)，其中超過(guò)70%的circRNAs起源于蛋白質(zhì)編碼外顯子，其次是內(nèi)含子和基因間區(qū)(圖1C)。在建立篩選標(biāo)準(zhǔn)后，倍數(shù)變化(FC)≥|2|且P<0.005，我們得到5個(gè)circRNAs在結(jié)直腸腫瘤組織中的表達(dá)明顯低于NATs(圖1D-E)。我們使用exoRBase數(shù)據(jù)庫(kù)注釋外泌體中的circRNAs，發(fā)現(xiàn)了三種外泌體circRNAs，由RNA-Seq測(cè)定，豐度較高(圖1F-G)。與正常FHC細(xì)胞相比，hsa_circ_0087960(來(lái)源于LPAR1，以下稱為circLPAR1)是唯一在結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT116和DLD1)中表達(dá)顯著下調(diào)的細(xì)胞系中得到驗(yàn)證的circRNA(圖1H)。

隨后，我們從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化了外泌體(FHC-Exos和HCT116/DLD1-Exos)，并觀察到典型的外泌體特征：直徑50–100 nm且呈杯狀，表達(dá)標(biāo)記蛋白TSG101和Alix(圖1I-K)。circLPAR1在HCT116/DLD1-Exos中的表達(dá)低于FHC-Exos(圖1L)。外泌體分泌抑制劑GW4869處理后，細(xì)胞培養(yǎng)液中circLPAR1水平顯著降低(補(bǔ)充圖未展示)。

圖1：組織中circRNAs的分析和外泌體circLPAR1的選擇。從FHC、HCT116和DLD1細(xì)胞分離的外泌體分別命名為FHC-Exos、HCT116-Exos和DLD1-Exos

(2) circLPAR1在結(jié)直腸腫瘤中下調(diào)并與總生存率相關(guān)

circLPAR1是由位于chr9(113734352-113735838)上的LPAR1基因的外顯子3和外顯子4環(huán)狀生成。Sanger測(cè)序證明，circLPAR1長(zhǎng)226 bp并有一個(gè)頭尾相連的后剪接位點(diǎn)(圖2A)。為了檢驗(yàn)circLPAR1的穩(wěn)定性，我們用放線菌素D處理結(jié)直腸癌細(xì)胞，并觀察到circLPAR1比線性LPAR1轉(zhuǎn)錄物更穩(wěn)定(補(bǔ)充圖未展示)。與線性LPAR1轉(zhuǎn)錄本相比，circLPAR1對(duì)RNase R消化(線性RNA的降解劑)具有耐藥性(圖2B)。為了可視化circLPAR1的表達(dá)模式，我們使用包含79對(duì)結(jié)直腸腫瘤和NATs的組織微陣列進(jìn)行了FISH分析，circLPAR1在結(jié)直腸腫瘤中的表達(dá)水平顯著低于NATs (P=0.001；圖2C-D)。circLPAR1主要表達(dá)并定位于細(xì)胞質(zhì)(圖2E)。Kaplan-Meier分析表明，高circLPAR1水平的結(jié)直腸癌患者的總生存率明顯高于低circLPAR1水平的結(jié)直腸癌患者(HR=0.46，95%可信區(qū)間(CI)=0.24-0.87；P_log-rank=0.017；圖2F)。

圖2：circLPAR1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

(3) 血漿外泌體circLPAR1是結(jié)直腸癌診斷的特異性生物標(biāo)志物

考慮到circLPAR1在結(jié)直腸癌腫瘤中的下調(diào)表達(dá)模式，我們推測(cè)circLPAR1由血漿外泌體攜帶，并作為結(jié)直腸癌的特異性生物標(biāo)志物。每個(gè)分裂樣本在不同凍融循環(huán)或室溫維持不同時(shí)間(圖3A-B)后，血漿中外泌體circLPAR1水平?jīng)]有明顯變化(P>0.05)。結(jié)直腸癌患者的外泌體circLPAR1明顯低于無(wú)癌對(duì)照組(P<0.001)和息肉患者(P=0.039)，表明外泌體circLPAR1在從癌前到癌前的疾病發(fā)展過(guò)程中可能降低(圖3C)。我們?cè)谠S多癌癥中發(fā)現(xiàn)了相似的外泌體circLPAR1表達(dá)模式(圖3C)，包括GC、BRCA、BLCA、CESC、KIRC和LUAD (P>0.05)，這些模式均與結(jié)直腸癌的模式有顯著差異(P<0.001)。結(jié)直腸癌切除后外泌體circLPAR1水平顯著升高(P=0.001；圖3D)。圖3E中的ROC曲線顯示，在AUC為0.858的情況下，可以通過(guò)測(cè)量外泌體circLPAR1來(lái)區(qū)分結(jié)直腸癌患者和無(wú)癌對(duì)照組(95% CI=0.786-0.930，P<0.001)。CEA和CA19-9是兩種結(jié)直腸癌診斷的臨床生物標(biāo)志物，在患者血漿中顯著上調(diào)，但與外泌體circLPAR1比較，其AUC相對(duì)較低(CEA:AUC=0.706；Ca19-9:AUC=0.559；圖3E)。外泌體circLPAR1、CEA和CA19-9聯(lián)合使AUC值提高至0.875 (95% CI=0.809-0.941；P<0.001；圖3E)，敏感性和特異性分別為87.30%和76.30%。

圖3：血漿外泌體circLPAR1的表達(dá)模式及其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞表型的生物學(xué)影響。從HCT116和DLD1細(xì)胞分離的外泌體分別被命名為HCT116-Exos和DLD1-Exos。外泌體分別從轉(zhuǎn)染circLPAR1/對(duì)照表達(dá)質(zhì)粒的HCT116和DLD1細(xì)胞中分離，即circLPAR1-Exos和NC-Exos

(4) 外泌體circLPAR1在細(xì)胞間傳遞并抑制細(xì)胞表型

我們探討了外泌體circLPAR1在結(jié)直腸癌發(fā)生中的生物學(xué)功能。熒光顯微鏡觀察到HCT116和DLD1細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有PKH67綠色熒光染料，而非Exos組中未觀察到PKH67綠色熒光染料，提示HCT116/DLD1-Exos被結(jié)直腸癌細(xì)胞快速吞噬(圖3F)。我們從轉(zhuǎn)染了circLPAR1/NC載體(circLPAR1/NC-Exos)的結(jié)直腸癌細(xì)胞中分離出外泌體，發(fā)現(xiàn)直接與circLPAR1-Exos孵生顯著增加了HCT116和DLD1細(xì)胞中的circLPAR1水平(補(bǔ)充圖未展示)。外泌體circLPAR1顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、集合體形成、侵襲和遷移(圖3G-I)，與直接過(guò)表達(dá)circLPAR1得到的結(jié)果相似(補(bǔ)充圖未展示)。

(5) 外泌體circLPAR1通過(guò)與eIF3h相互作用調(diào)節(jié)BRD4水平抑制結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生

circLPAR1在細(xì)胞系和組織的細(xì)胞質(zhì)中富集(圖2E和4A)，促使我們分析受circLPAR1影響的特異性circRNA-RBP復(fù)合物。我們通過(guò)MS2-CP-Flag circRNA下拉試驗(yàn)進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析(圖4B)。圖4C-D證實(shí)了circLPAR1-MS2載體或MS2-CP的轉(zhuǎn)染效率。circRNA下拉產(chǎn)物富集捕獲蛋白MS2-CP-Flag，隨后捕獲的circLPAR1高度富集(圖4E)；這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)都表明了circRNA下拉實(shí)驗(yàn)的成功特異性。接下來(lái)的質(zhì)譜分析通過(guò)比較circLPAR1+MS2-CP轉(zhuǎn)染組和circLPAR1-MS2+MS2-CP轉(zhuǎn)染組，鑒定出23個(gè)分配給circLPAR1的候選RBPs(補(bǔ)充表未展示)。circLPAR1與6個(gè)RBPs顯著相關(guān)(MGN2、RL27A、SF3A3、SPT4H、IF4E2和eIF3h；P<0.05；圖4F)，其中4個(gè)RBPs (MGN2、RL27A、SF3A3和eIF3h)與其親本線性RNA呈正相關(guān)(補(bǔ)充表未展示)。

為了證實(shí)circLPAR1對(duì)eIF3h的結(jié)合親和力，我們確定了circLPAR1和eIF3h在結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的共定位(圖4G)。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與NC/NC-Exos組細(xì)胞相比，經(jīng)circLPAR1慢病毒載體轉(zhuǎn)染或與circLPAR1-Exos孵育的結(jié)直腸癌細(xì)胞中，circLPAR1或外泌體circLPAR1與eIF3h特異性沉淀(圖4H)。這表明外泌體circLPAR1直接與eIF3h相互作用。eIF3h與METTL3之間存在直接的物理和功能相互作用，可以調(diào)節(jié)BRD4的翻譯，影響腫瘤發(fā)生(圖4I)。如圖4J所示，與NC/NC-Exos組相比，經(jīng)circLPAR1慢病毒載體轉(zhuǎn)染或經(jīng)circLPAR1-Exos孵育的結(jié)直腸癌細(xì)胞中，circLPAR1降低了BRD4蛋白水平。BRD4表達(dá)質(zhì)粒提高了circLPAR1表達(dá)導(dǎo)致的BRD4水平下降，促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞表型的獲得，而AZD5153逆轉(zhuǎn)了高BRD4水平的促瘤作用(補(bǔ)充圖未展示)。circLPAR1可以海綿miR-762促進(jìn)膀胱癌的侵襲轉(zhuǎn)移。我們測(cè)量了上述circRNA下拉產(chǎn)物中的miR-762水平，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)miR-762與circLPAR1一起富集(補(bǔ)充圖未展示)。

圖4：外泌體circLPAR1通過(guò)結(jié)合eIF3h調(diào)節(jié)BRD4翻譯。將circLPAR1和對(duì)照慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染到DLD1細(xì)胞，分別作為circLPAR1組和NC組。從轉(zhuǎn)染circLPAR1和對(duì)照慢病毒載體的DLD1細(xì)胞中分離外泌體，分別作為circLPAR1-Exos組和NC-Exos組

(6) 外泌體circLPAR1在體內(nèi)抑制結(jié)直腸癌生長(zhǎng)

為了在體內(nèi)驗(yàn)證外泌體circLPAR1對(duì)結(jié)直腸癌的抑制作用，我們將穩(wěn)定的circLPAR1/NC-過(guò)表達(dá)細(xì)胞或1,1-二八胱氨酸-3,3,3,3四甲基多三碳氰化鈉(DiR)染色的circLPAR1/NC-Exos注射到人化的NCG小鼠體內(nèi)(圖5A)。與體外結(jié)果一致，與NC表達(dá)或NC-Exos處理相比，circLPAR1過(guò)表達(dá)或circLPAR1-Exos處理降低了腫瘤的平均大小和重量(圖5B-C)。circLPAR1和circLPAR1-Exos組腫瘤組織的生長(zhǎng)速度比NC/NC-Exos組腫瘤組織的生長(zhǎng)速度慢(圖5D)。活體成像結(jié)果還顯示，DiR染色的circLPAR1/NC-Exos成功注射到小鼠體內(nèi)(圖5E)。與NC/NC-Exos組相比，circLPAR1或circLPAR1-Exos組腫瘤的circLPAR1水平更高(補(bǔ)充圖未展示)。蘇木素和伊紅(H&E)染色和免疫組化(IHC)分析顯示circLPAR1和circLPAR1-Exos組Ki67和BRD4受損(圖5F-G)。

圖5：體外靶向外泌體cricLPAR1的作用。將經(jīng)circLPAR1/NC慢病毒載體轉(zhuǎn)染的DLD1細(xì)胞株注射到人源化的NCG小鼠體內(nèi)，分別標(biāo)記為circLPAR1和NC，再將DiR標(biāo)記的circLPAR1/NC-Exos注射到NC小鼠體內(nèi)，分別標(biāo)記為circLPAR1-Exos和NC-Exos

結(jié)論：

本研究強(qiáng)調(diào)了一種新的結(jié)直腸癌相關(guān)circRNA，稱為外泌體circLPAR1，它在從血漿中獲得的外泌體中檢測(cè)到，可能作為一種非侵入性生物標(biāo)志物，用于結(jié)直腸癌的早期檢測(cè)。機(jī)制上，外泌體circLPAR1表達(dá)水平導(dǎo)致BRD4水平下降，因?yàn)樗Y(jié)合eIF3h并抑制METTL3-eIF3h相互作用，從而顯著抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展。本研究不僅報(bào)道了外泌體circRNA在結(jié)直腸癌中的新機(jī)制，而且為結(jié)直腸癌的診斷方法開(kāi)辟了新的途徑。

參考文獻(xiàn)：

Zheng, R., Zhang, K., Tan, S., Gao, F., Zhang, Y., Xu, W., Wang, H., Gu, D., Zhu, L., Li, S., Chu, H., Zhang, Z., Liu, L., Du, M., & Wang, M. (2022). Exosomal circLPAR1 functions in colorectal cancer diagnosis and tumorigenesis through suppressing BRD4 via METTL3-eIF3h interaction. Molecular cancer, 21(1), 49. https://doi.org/10.1186/s12943-021-01471-y.