基于癌相關(guān)成纖維細(xì)胞激活評(píng)分系統(tǒng)的肝細(xì)胞癌人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)后模型

肝細(xì)胞癌（HCC）占原發(fā)性肝癌的80%以上，是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因。對(duì)于HCC患者，明確其進(jìn)展機(jī)制和預(yù)測(cè)預(yù)后至關(guān)重要。先前的研究發(fā)現(xiàn)，癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）促進(jìn)腫瘤增殖和免疫排斥。近日，有作者基于CAFs相關(guān)基因構(gòu)建了一種新的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN） 模型，通過功能、突變、免疫和臨床分析揭示了關(guān)于ANN模型的信息。研究于2022年7月發(fā)表在《Frontiers in immunology》，IF:8.786。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. HCC單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析及CAFs相關(guān)基因功能富集

作者將單細(xì)胞的6個(gè)亞群（包括惡性細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）、腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞（TECs）和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs））進(jìn)行分離，并繪制UMAP圖（圖1A）。然后，使用Monocle 2進(jìn)行偽時(shí)間分析，發(fā)現(xiàn)CAFs出現(xiàn)在分化軌跡的末端（圖1B）。此外，在六個(gè)亞簇之間進(jìn)行了配體-受體相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖1C），并提取了CAFs與其他亞簇之間配體-受體對(duì)的數(shù)量（圖1D）。作者證明了CAFs和TECs具有最多的配體-受體對(duì)，其次是CAFs和TAMs。隨后，在CAFs和其他亞簇之間進(jìn)行了配體-受體相互作用（圖1E）。選擇與CAFs顯著相關(guān)的基因進(jìn)行功能富集分析，它們主要富集在與腫瘤相關(guān)的通路，如PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路、血管發(fā)育、受體酪氨酸激酶信號(hào)通路以及細(xì)胞遷移的正向調(diào)控（圖1F和G）。

圖1 CAFs相關(guān)基因的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析及功能

2. 12個(gè)CAFs相關(guān)基因被確定為HCC的預(yù)測(cè)模型

單變量Cox回歸分析進(jìn)一步篩選TCGA數(shù)據(jù)集中與CAFs相關(guān)的預(yù)后基因：14個(gè)基因被選中（圖2A）。為了進(jìn)一步獲得最嚴(yán)格的模型，進(jìn)行隨機(jī)森林分析并篩選候選基因。最后，選擇12個(gè)可變重要值大于0的CAFs相關(guān)基因作為HCC患者的預(yù)后模型（圖2B）。然后，繪制12個(gè)與CAFs相關(guān)的預(yù)后基因的突變圖譜（圖2C），發(fā)現(xiàn)HGF的突變率最高（24%），其次是CD44 （12%），CSF1和NRP1（6%），最高的突變類型是錯(cuò)義突變。突變分析結(jié)果中常見的變異和變異類型分別是錯(cuò)義突變和單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。單核苷酸變異數(shù)顯示，胞嘧啶（C）向腺嘌呤（A）突變最為常見（圖2D）。每個(gè)樣本的中位數(shù)變異為1。此外，作者列出了前10個(gè)突變基因供進(jìn)一步分析。隨后，在TCGA數(shù)據(jù)集中對(duì)12個(gè)與CAFs相關(guān)的預(yù)后基因進(jìn)行了CNV分析（圖2E），發(fā)現(xiàn)EFNA4具有最高的CNV增益突變，而CSF1具有最高的CNV損失突變。然后，構(gòu)建一個(gè)圓形圖來展示12個(gè)與CAFs相關(guān)的預(yù)后基因之間的相關(guān)性（圖2F），結(jié)果發(fā)現(xiàn)12個(gè)與CAFs相關(guān)的預(yù)后基因均為危險(xiǎn)因素，且p值< 0.0001，呈強(qiáng)正相關(guān)。

圖2 12個(gè)與CAFs預(yù)后相關(guān)基因的鑒定

3. 基于12個(gè)與CAFs相關(guān)的預(yù)后基因，建立了ANN預(yù)測(cè)模型

基于TCGA數(shù)據(jù)集中12個(gè)選擇的與CAFs相關(guān)的預(yù)后基因構(gòu)建了一個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型（圖3A）。輸入層輸入12個(gè)CAFs相關(guān)基因。網(wǎng)絡(luò)超參數(shù)為:a） 3個(gè)隱層；B）每層35、27、19個(gè)節(jié)點(diǎn)；C） dropout rate= 0.286；D） learning rate= 0.4621984；e） weight decay= 0.3156897。結(jié)果：輸出層包含一個(gè)神經(jīng)元，通過Cox回歸計(jì)算CAS。為了評(píng)估預(yù)測(cè)能力，引入c指數(shù)。在ANN模型中c指數(shù)高于Cox模型。此外，在ICGC和GSE76427數(shù)據(jù)集中，c指數(shù)是令人滿意的（圖3B）。通過AUC分析，ANN模型優(yōu)于Cox模型 （圖3C）。隨后，在TCGA數(shù)據(jù)集中計(jì)算每個(gè)樣本的CAS（圖3D），CAS高的患者生存狀態(tài)較差，反之亦然。通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)集進(jìn)行Kaplan-Meier分析，發(fā)現(xiàn)高CAS的HCC患者總生存期較短（P = 0.0065）（圖3E）。為了評(píng)估ANN模型的準(zhǔn)確性，對(duì)TCGA、ICGC和GSE76427數(shù)據(jù)集進(jìn)行了ROC分析，發(fā)現(xiàn)TCGA數(shù)據(jù)集中的1年、3年和5年AUC均大于0.6（圖3F），這表明我們的ANN模型是一個(gè)準(zhǔn)確的預(yù)后模型。

圖3建立ANN模型

4. 基于CAFs相關(guān)ANN模型構(gòu)建nomogram圖

為了評(píng)估ANN模型是否可以作為獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志物，對(duì)三個(gè)隊(duì)列（TCGA、ICGC和GSE76427）進(jìn)行了單變量和多變量Cox回歸分析（圖4A, B）。單因素和多因素Cox回歸結(jié)果顯示， ANN模型的CAS與三個(gè)隊(duì)列中較低的總生存率顯著相關(guān)，這表明ANN模型可以作為HCC患者的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。因此，作者建立了一個(gè)基于CAS的nomogram圖來預(yù)測(cè)HCC患者的1年、3年和5年的總生存期（圖4C）。然后，建立評(píng)估預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)與觀察風(fēng)險(xiǎn)的校準(zhǔn)曲線（圖4D）。1年、3年和5年的校準(zhǔn)曲線顯示出很大的預(yù)測(cè)能力。此外，nomogram的AUC表明nomogram與單個(gè)參數(shù)相比具有最高的AUC（圖4E）。最后，通過1年、3年和5年的DCA評(píng)估該模型是否值得使用（圖4F），結(jié)果表明nomogram檢查對(duì)HCC患者是可以接受的。

圖4肝細(xì)胞癌患者計(jì)數(shù)圖的創(chuàng)建

5. CAFs相關(guān)ANN模型的富集分析

通過分析高CAS和低CAS樣本之間的差異表達(dá)基因，并將基因輸入在線富集分析工具metscape。高CAFs組中顯著富集的terms如圖5A所示：排在前五位的是基質(zhì)金屬蛋白酶、己糖反應(yīng)、膜電位調(diào)節(jié)、含苯化合物代謝過程、甾體分解代謝過程。CAS組中顯著富集的terms如圖5B所示：前五項(xiàng)分別是核心母質(zhì)體、ECM組織、母質(zhì)體相關(guān)、蛋白多糖和細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)。GSEA分析顯示低CAS組中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、抗原加工和遞呈、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、結(jié)點(diǎn)樣受體信號(hào)通路和toll樣受體信號(hào)通路富集，而高CAS組中鈣信號(hào)通路、ECM受體相互作用、Notch信號(hào)通路、核糖體和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）信號(hào)通路富集 （圖5C, D）。然后，根據(jù)CAS相關(guān)基因的中位表達(dá)，將樣本分為兩個(gè)亞組（高組和低組），并確定高組的激活細(xì)胞串?dāng)_高于低組（圖5E）。作者總結(jié)顯著的串?dāng)_通路，結(jié)果表明高組可以激活大部分通路（圖5F）。此外，我們分析了一些關(guān)注的通路（圖5G），發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞共抑制，血管生成和主要組織相容性復(fù)合體I類在高CAS樣本中顯著上調(diào)。然而，II型干擾素（IFN）反應(yīng)通路在低CAS樣本中顯著富集。此外，CAS和通路之間的相關(guān)性如圖2所示， T細(xì)胞共抑制與CAS有最顯著的正相關(guān)性。

圖5 ANN模型的功能分析

6. CAFs相關(guān)ANN模型的免疫分析

根據(jù)有或無顯著性的風(fēng)險(xiǎn)或保護(hù)因素，將22例TIC分為4組，并進(jìn)行相關(guān)分析（圖6A），證明了M0巨噬細(xì)胞和活化的樹突狀細(xì)胞是危險(xiǎn)因素，而靜息記憶CD4 T細(xì)胞是保護(hù)因素。作者發(fā)現(xiàn)22個(gè)tic之間存在正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。然后，繪制一個(gè)熱圖來分析TME和腫瘤純度以及TICs和免疫能力的表達(dá)（圖6B）。高CAS樣本的免疫評(píng)分和ESTIMATE評(píng)分均顯著升高，且與CAS呈正相關(guān)。激活的記憶CD4 T細(xì)胞、卵泡輔助T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在高CAS樣本中高表達(dá)，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和靜息性記憶CD4 T細(xì)胞在低CAS樣本中高表達(dá)，CD8 T細(xì)胞在低CAS患者中高表達(dá)。檢查點(diǎn)CTLA4、IDO1和CD274在高CAS樣本中高表達(dá)，而TBX2在低CAS樣本中顯著高表達(dá)。此外，在高CAS和低CAS樣本之間對(duì)75種免疫調(diào)節(jié)劑進(jìn)行了多組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)包括14個(gè)抗原遞呈因子、3個(gè)共刺激因子、8個(gè)共抑制劑、22個(gè)配體、19個(gè)受體、3個(gè)細(xì)胞粘附因子和6個(gè)其他因子（圖6C）。檢測(cè)mRNA的表達(dá)，突變，擴(kuò)增和缺失的頻率，以及基因表達(dá)與DNA甲基化β值在高和低CAS樣本之間的相關(guān)性。最后，在高CAS樣本和低CAS樣本之間檢測(cè)了癌癥-睪丸抗原（CTA）（圖6D）、新抗原（圖6E）和增殖（圖6F）評(píng)分。CTA評(píng)分可加快腫瘤發(fā)生速度，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。高CAS樣本具有更高的CTA評(píng)分、新抗原表達(dá)和增殖能力。通過相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)CAS與CTA評(píng)分（P= 0.03）、新抗原（P= 0.0014）、增殖（P= 0.044）呈顯著正相關(guān)。

圖6 ANN模型的免疫分析

7. CAFs相關(guān)ANN模型的突變分析

對(duì)低CAS和高CAS樣本進(jìn)行突變分析。首先，檢測(cè)所有突變計(jì)數(shù)：非同義突變和同義突變計(jì)數(shù)（圖7A）。然而沒有發(fā)現(xiàn)兩組之間有任何顯著性。此外，篩選26個(gè)突變數(shù)超過15的基因，隨后在高CAS和低CAS樣本中展示了突變景觀（圖7B）。高CAS樣本中突變頻率最高的基因是TP53（33%），其次是CTNNB1（25%）和TTN（24%）。相比之下，低CAS樣本中突變頻率最高的基因是CTNNB1（25%），其次是TTN（25%）和TP53（23%）。森林圖展示高CAS和低CAS樣本之間的差異突變基因 （圖7C）：NBEA和FRAS1在高CAS樣本中突變數(shù)較高，RYR2在低CAS樣本中突變數(shù)較高。由于TP53在高CAS樣本中具有最高的突變計(jì)數(shù)百分比，因此生成TP53的lollipop圖來展示高CAS和低CAS樣本中的突變頻率和突變類型（圖7D）。柱狀圖來展示了高CAS和低CAS樣本中每個(gè)臂的擴(kuò)增和缺失頻率（圖7E）。

圖7 ANN的突變分析

8. ANN模型可指導(dǎo)臨床治療

HCC的主要治療方法之一是化療，其中包括5-氟尿嘧啶、順鉑、吉西他濱和多柔比星。因此，作者預(yù)測(cè)了TCGA數(shù)據(jù)集中高CAS和低CAS樣本之間化療藥物的敏感性（圖8A）。3種藥物（5-氟尿嘧啶、順鉑和吉西他濱）在高CAS樣本中的敏感性高于低CAS樣本（p值分別為0.00063、0.018和0.00045）。此外，利用CTRP和PRISM數(shù)據(jù)庫對(duì)小分子藥物進(jìn)行了預(yù)測(cè)（圖8B）。Brefeldin A、SR-II-138A、CR-1-31B、BRD-K97651142、KX2-391、tosedostat與CAS呈負(fù)相關(guān)，高CAS樣本的AUC估計(jì)值較低。結(jié)果表明，預(yù)測(cè)的小分子藥物在高CAS患者中具有較高的敏感性。此外，通過使用TCGA數(shù)據(jù)集中的子類映射來預(yù)測(cè)針對(duì)PD1和CTLA4的免疫反應(yīng)（圖8C）。然后，通過TIDE算法檢測(cè)高CAS和低CAS樣本之間的總免疫應(yīng)答（圖8D）。

圖8預(yù)測(cè)藥物和免疫反應(yīng)

結(jié)論：

作者創(chuàng)建了一個(gè)新的與CAFs相關(guān)的ANN模型，該模型適用于單獨(dú)預(yù)測(cè)HCC患者的預(yù)后，并通過功能、突變、免疫和臨床分析指導(dǎo)臨床治療。