LncRNA ELF3-AS1通過與SNAI2形成負(fù)反饋環(huán)路抑制胃癌，并通過與ILF2/ILF3復(fù)合物相互作用調(diào)節(jié)ELF3 mRNA的穩(wěn)定性

胃癌（GC）是癌癥相關(guān)死亡的第三大常見原因。盡管GC的治療已得到極大改善，但由于無法在早期診斷該癌癥，生存率仍然很低。約1/3的GC患者被診斷為晚期轉(zhuǎn)移，4-14%的患者有肝臟轉(zhuǎn)移性疾病。由于GC轉(zhuǎn)移通常以多發(fā)性和彌漫性分布為特征，絕大多數(shù)患者此時(shí)已失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。因此，迫切需要解開腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。越來越多的證據(jù)表明，SNAI2通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下游靶基因在驅(qū)動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，揭示SNAI家族的靶基因?qū)τ诟玫亓私饽[瘤轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。ELF3-AS1是一種細(xì)胞周期相關(guān)的lncRNA，據(jù)報(bào)道lncRNA ELF3-AS1在肺癌中作為癌基因起作用。然而，ELF3-AS1在GC中的生物學(xué)功能尚不清楚。該研究發(fā)表于《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF: 12.658。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. GC中轉(zhuǎn)錄阻遏因子SNAI2調(diào)控lncRNA的探索

為了探索SNAI2的靶基因，RNA測(cè)序研究（GSE161551）在過表達(dá)SNAI2的GC細(xì)胞系（SGC7901）中進(jìn)行。共有318個(gè)編碼基因，其中70個(gè)lncRNA被SNAI2強(qiáng)烈抑制，55個(gè)編碼基因和53個(gè)lncRNA被SNAI2大幅上調(diào)。如圖1A所示，IGFBP1/3、ITGB4、CLDN1/4、TJP3、EFNA1、KRT80、ELF3等的表達(dá)受到SNAI2的強(qiáng)烈抑制，而CYR61、CTGF、IL11、ID2/3、RBM3、THBS1等的表達(dá)受到SNAI2的強(qiáng)烈上調(diào)。類似地，大約123個(gè)lncRNA，包括linc01315，MIR210HG，FZD10-DT，linc00963，HOXB-AS3，LUCAT1，ITPR1-DT，PDCD4-AS1，ZNF197-AS1等，在過表達(dá)SNAI2后極大地改變了它們的表達(dá)。有趣的是，反義lncRNA ELF3-AS1及其鄰近基因ELF3都被SNAI2強(qiáng)烈抑制（圖1B)。

為了進(jìn)一步確認(rèn)ELF3-AS1和ELF3是否可能受到SNAI2的負(fù)調(diào)節(jié)，在兩個(gè)GC細(xì)胞系中進(jìn)行了關(guān)于SNAI2的功能喪失和功能獲得研究。正如預(yù)期的那樣，ELF3-AS1和ELF3在SNAI2過表達(dá)細(xì)胞系中顯著下調(diào)，但在SNAI2去除細(xì)胞系中顯著上調(diào)（圖1C-E）。這些結(jié)果表明，在GC中，SNAI2對(duì)ELF3-AS1和ELF3均呈負(fù)調(diào)控。

ELF3-AS1是上皮腫瘤抑制基因ELF3的反義lncRNA。啟動(dòng)子分析顯示，ELF3-AS1啟動(dòng)子含有一個(gè)序列“GGTACAGGTGGGT”，預(yù)測(cè)被SNAI2和SNAI1識(shí)別。該序列位于ELF3-AS1轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游829 bp，這也是ELF3基因外顯子2和內(nèi)含子2之間的連接點(diǎn)（圖1F）。因此，作者推測(cè)ELF3-AS1和ELF3可能受到SNAI2和SNAI1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

圖1 通過RNA-seq鑒定GC中SNAI2調(diào)控的lncRNA

2. ELF3-AS1和ELF3被SNAI2和SNAI1轉(zhuǎn)錄抑制

LncRNA ELF3-AS1在人體細(xì)胞中含量豐富，在RNA測(cè)序時(shí)可被磁珠有效捕獲。為了使作者的結(jié)果更具說服力，作者使用RNA-seq研究來可視化ELF3-AS1和ELF3的表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，RNA-seq分析和qRT-PCR測(cè)定共同表明ELF3-AS1和ELF3被SNAI2 / SNAI1過表達(dá)下調(diào)（圖2A-F）。此外，SNAI2對(duì)ELF3和ELF3-AS1表達(dá)的抑制強(qiáng)度遠(yuǎn)大于SNAI1（圖2B，E）。

此外，為了確定SNAI2/SNAI1是否在轉(zhuǎn)錄水平上抑制ELF3 / ELF3-AS1，在SNAI1和SNAI2過表達(dá)細(xì)胞系中進(jìn)行雙熒光素酶和CHIP測(cè)定。如圖2G所示，當(dāng)SNAI1/2結(jié)合序列發(fā)生突變時(shí)，SNAI1/2過表達(dá)對(duì)熒光素酶表達(dá)的強(qiáng)烈抑制部分恢復(fù)，提示該序列是SNAI1/SNAI2抑制ELF3/ELF3-AS1表達(dá)所必需的。另一方面，CHIP測(cè)定表明SNAI1和SNAI2可以直接與ELF3-AS1啟動(dòng)子結(jié)合（圖2H-J）。綜上所述，SNAI2和SNAI1都參與了GC中ELF3和ELF3-AS1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

圖2 ELF3-AS1和ELF3在GC中被SNAI2和SNAI1轉(zhuǎn)錄抑制

3. ELF3-AS1和ELF3表達(dá)降低預(yù)示GC預(yù)后不良

由于ELF3和ELF3-AS1被EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SNAI1/2抑制，作者進(jìn)一步進(jìn)行了ELF3/ELF3-AS1與EMT生物標(biāo)志物的基因表達(dá)相關(guān)性分析。正如預(yù)期的那樣，ELF3和ELF3-AS1都與上皮生物標(biāo)志物高度共表達(dá)（圖3A)。

此外，對(duì)30對(duì)GC組織中ELF3-AS1表達(dá)的分析表明，與相應(yīng)的正常樣品相比，ELF3-AS1在超過80%的GC樣品中下調(diào)（圖3B）。另一方面，作者分析了癌癥基因組圖譜（TCGA，n = 375）數(shù)據(jù)庫中GC樣本中ELF3-AS1下調(diào)的臨床意義。LncRNA ELF3-AS1在彌漫性和低分化的GC組織中表達(dá)低（圖3C和D）?？偵嫫诜治霰砻?，ELF3-AS1表達(dá)水平較低的GC患者總生存時(shí)間較短（圖3E，p=0.029）。

作者之前的研究暗示ELF3在GC中起腫瘤抑制作用。在此，作者進(jìn)一步確認(rèn)了ELF3在GC中的表達(dá)顯著下調(diào)（圖3F，G）。此外，與腸道GC相比，在彌漫性GC中觀察到ELF3的表達(dá)較低（圖3H）。3ELF3的低表達(dá)與GC的惡性進(jìn)展呈正相關(guān)（圖3I，J）。ELF3表達(dá)較低的GC患者總生存時(shí)間和無病生存時(shí)間較差GSE62254GC隊(duì)列（圖3K）。臨床分析與作者的發(fā)現(xiàn)非常吻合，即ELF3-AS1和ELF3在GC中被SNAI2和SNAI1轉(zhuǎn)錄抑制。

圖3 ELF3-AS1和ELF3表達(dá)降低與GC預(yù)后不良相關(guān)

4. 上皮轉(zhuǎn)錄因子ELF3在GC中發(fā)揮腫瘤抑制作用

反義lncRNA通常與其相鄰的蛋白質(zhì)編碼基因高度共表達(dá)。同樣，作者還觀察到ELF3-AS1和ELF3在正常胃組織，GC細(xì)胞系和泛組織中存在高共表達(dá)（圖4A-E）。有趣的是，當(dāng)ELF3-AS1在GC細(xì)胞系中被有效敲低時(shí)，ELF3 mRNA及其蛋白質(zhì)顯著降低至約60-70%（圖4F-I）。然而，目前尚不清楚ELF3-AS1如何影響GC中的ELF3表達(dá)。

此外，對(duì)30對(duì)GC組織中ELF3-AS1表達(dá)的分析表明，與相應(yīng)的正常樣品相比，ELF3-AS1在超過80%的GC樣品中下調(diào)（圖3B）。另一方面，作者分析了癌癥基因組圖譜（TCGA，n = 375）數(shù)據(jù)庫中GC樣本中ELF3-AS1下調(diào)的臨床意義。LncRNA ELF3-AS1在彌漫性和低分化的GC組織中表達(dá)低（圖3C和D）?？偵嫫诜治霰砻?，ELF3-AS1表達(dá)水平較低的GC患者總生存時(shí)間較短（圖3E，p=0.029）。

作者之前的研究暗示ELF3在GC中起腫瘤抑制作用。在此，作者進(jìn)一步確認(rèn)了ELF3在GC中的表達(dá)顯著下調(diào)（圖3F，G）。此外，與腸道GC相比，在彌漫性GC中觀察到ELF3的表達(dá)較低（圖3H）。ELF3的低表達(dá)與GC的惡性進(jìn)展呈正相關(guān)（圖3I，J）。ELF3表達(dá)較低的GC患者總生存時(shí)間和無病生存時(shí)間較差GSE62254GC隊(duì)列（圖3K）。臨床分析與作者的發(fā)現(xiàn)非常吻合，即ELF3-AS1和ELF3在GC中被SNAI2和SNAI1轉(zhuǎn)錄抑制。

5. 上皮轉(zhuǎn)錄因子ELF3在GC中發(fā)揮腫瘤抑制作用

反義lncRNA通常與其相鄰的蛋白質(zhì)編碼基因高度共表達(dá)。同樣，作者還觀察到ELF3-AS1和ELF3在正常胃組織，GC細(xì)胞系和泛組織中存在高共表達(dá)（圖4A-E）。有趣的是，當(dāng)ELF3-AS1在GC細(xì)胞系中被有效敲低時(shí)，ELF3 mRNA及其蛋白質(zhì)顯著降低至約60-70%（圖4F-I）。然而，目前尚不清楚ELF3-AS1如何影響GC中的ELF3表達(dá)。

鑒于ELF3屬于ETS轉(zhuǎn)錄因子家族，作者最初假設(shè)ELF3-AS1和ELF3的共表達(dá)可能是由于ELF3調(diào)節(jié)ELF3-AS1的表達(dá)。為了驗(yàn)證這種可能性，在兩個(gè)GC細(xì)胞系中進(jìn)行了關(guān)于ELF3的功能喪失和功能獲得研究。然而，在GC中敲低或過表達(dá)ELF3后，ELF3-AS1的表達(dá)沒有顯著改變（圖4J和K）。盡管轉(zhuǎn)錄因子ELF3不能調(diào)節(jié)ELF3-AS1的表達(dá)，但劃痕傷口愈合測(cè)定和Transwell測(cè)定證實(shí)ELF3在GC細(xì)胞遷移和侵襲中具有腫瘤抑制作用（圖4L和M）。

圖4 ELF3負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但不能調(diào)節(jié)GC中ELF3-AS1的表達(dá)

6. ELF3-AS1主要通過抑制SNAI2信號(hào)傳導(dǎo)抑制GC轉(zhuǎn)移

作者通過miRNA測(cè)序分析了ELF3-AS1敲低后差異表達(dá)的miRNA（圖5A）。令人驚訝的是，在ELF3-AS1耗竭大幅下調(diào)的前10種miRNA中，miR-33a，miR-33b和miR-203a是眾所周知的靶向SNAI2的miRNA（圖5B）。為了確認(rèn)miRNA測(cè)序的可靠性，作者檢查了ELF3-AS1去除細(xì)胞系中miR-33a，miR-33b和miR-203a的表達(dá)水平。結(jié)果表明，ELF3-AS1敲低確實(shí)能顯著降低miR-33a、miR-33b和miR-203a的表達(dá)（圖5C-E）。相應(yīng)地，ELF3-AS1的耗竭導(dǎo)致SNAI2 mRNA和蛋白質(zhì)的顯著上調(diào)（圖5F-H）。一致地，分析來自另一項(xiàng)獨(dú)立研究的RNA-seq數(shù)據(jù)（GSE92250）還表明ELF3-AS1敲低導(dǎo)致A549和Hela細(xì)胞系中的SNAI2 mRNA上調(diào)（圖5I），表明ELF3-AS1對(duì)SNAI2表達(dá)的負(fù)調(diào)控可能在癌癥中廣泛存在。

基于上述發(fā)現(xiàn)，作者推測(cè)ELF3-AS1可能通過抑制SNAI2信號(hào)傳導(dǎo)來抑制GC進(jìn)展。為了驗(yàn)證這種可能性，在體內(nèi)和體外進(jìn)行了救援測(cè)定。敲低SNAI2表達(dá)挽救了ELF3-AS1去除的GC細(xì)胞系的致瘤特性（圖5J和K）。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，ELF3-AS1主要通過抑制SNAI2信號(hào)傳導(dǎo)來抑制GC細(xì)胞的遷移和侵襲。

圖5ELF3-AS1主要通過抑制SNAI2信號(hào)傳導(dǎo)來抑制GC轉(zhuǎn)移

7. 核定位的lncRNA ELF3-AS1在細(xì)胞周期進(jìn)程中起關(guān)鍵作用。

lncRNA的生物學(xué)功能與其亞細(xì)胞位置密切相關(guān)。ELF3-AS1是GC中的核定位lncRNA（圖6A和B）。之前的一項(xiàng)研究報(bào)道，ELF3-AS1是一種細(xì)胞周期相關(guān)的lncRNA。作者的研究還表明，lncRNA ELF3-AS1在細(xì)胞周期進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用。ELF3-AS1敲低顯著加速了GC中細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)變（圖6C和D）。有趣的是，RNA-seq分析表明，敲低ELF3-AS1導(dǎo)致幾乎所有組蛋白編碼基因的顯著上調(diào)超過2倍（圖6E和F）。眾所周知，組蛋白的合成發(fā)生在細(xì)胞周期的S期，與DNA復(fù)制同步。這些結(jié)果表明，ELF3-AS1通過影響G1/S轉(zhuǎn)換和組蛋白合成來負(fù)調(diào)節(jié)GC細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。

為了更好地理解ELF3-AS1調(diào)控細(xì)胞周期過程的分子機(jī)制，作者分析了ELF3-AS1敲低后細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果表明，敲低ELF3-AS1增加了GC中CDK6和CASP7的表達(dá)，但降低了CDKN1A（也稱為p21）的表達(dá)（圖6G和H）。p21蛋白作為G1/S轉(zhuǎn)變的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)。CDK6/CCND1蛋白復(fù)合物對(duì)細(xì)胞周期G1相進(jìn)展和G1/S轉(zhuǎn)變非常重要。因此，ELF3-AS1敲低引起的G1/S轉(zhuǎn)變的促進(jìn)可能是由于P21的下調(diào)和CDK6的上調(diào).

圖6 核定位的lncRNA ELF3-AS1通過影響G1 / S過渡和組蛋白合成來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程

8. ILF2/ILF3復(fù)合物可直接調(diào)節(jié)ELF3-AS1/ELF3 RNA雙鏈體的穩(wěn)定性

通過RNA下拉分析鑒定了與lncRNA ELF3-AS1相互作用的潛在蛋白質(zhì)。根據(jù)位于45道爾頓處的差分帶的質(zhì)譜（MS）分析（圖7A），有7種蛋白質(zhì)匹配覆蓋率大于20%。在這些蛋白質(zhì)中，RINI，ILF2（也稱為NF45）和TARBP2是雙鏈RNA（dsRNA）結(jié)合蛋白（圖7B）。有趣的是，另一種名為ILF3的蛋白質(zhì)（也稱為NF90 / NF110）也出現(xiàn)在該條帶的MS結(jié)果中（圖7C）。作者隨后的蛋白質(zhì)印跡測(cè)定進(jìn)一步驗(yàn)證了ILF2，ILF3和TARBP2可以與外源性lncRNA ELF3-AS1結(jié)合（圖7D）。此外，CHIRP下拉試驗(yàn)證實(shí)內(nèi)源性ELF3-AS1也與ILF2和ILF3蛋白結(jié)合（圖7E和F）。維恩圖顯示，在三個(gè)MS結(jié)果的交點(diǎn)處顯示了大約22種蛋白質(zhì)，包括ILF2，ILF3，RINI等（圖7F）。為了弄清楚ELF3-AS1轉(zhuǎn)錄本的哪個(gè)區(qū)域可以與ILF2和ILF3相互作用，作者截?cái)嗔瞬煌L度的ELF3-AS1轉(zhuǎn)錄本。在通過蛋白質(zhì)印跡分析了不同長度的ELF3-AS1轉(zhuǎn)錄本拉下的蛋白質(zhì)后，作者發(fā)現(xiàn)第一個(gè)外顯子區(qū)域?qū)τ?/span>ELF3-AS1轉(zhuǎn)錄本與ILF2 / ILF3復(fù)合物之間的相互作用是必需的（圖7G）。此外，作者在轉(zhuǎn)染不同長度的ELF3-AS1轉(zhuǎn)錄本的GC細(xì)胞中檢測(cè)到ELF3表達(dá)。結(jié)果表明，僅過表達(dá)含有外顯子1的ELF3-AS1轉(zhuǎn)錄本上調(diào)ELF3表達(dá)（圖7H）。RNA免疫沉淀測(cè)定顯示，與ILF2和ILF3蛋白結(jié)合的ELF3-AS1轉(zhuǎn)錄本比對(duì)照IgG組高數(shù)千倍（圖7I，J）。

圖7 ELF3-AS1直接與ILF2 / ILF3蛋白復(fù)合物相互作用

由于選擇性剪接，ELF3基因具有不同的轉(zhuǎn)錄本。在這些不同類型的ELF3轉(zhuǎn)錄本中，ELF3-201，ELF3-202和ELF3-203可以編碼全長ELF3蛋白。ELF3-201轉(zhuǎn)錄本和ELF3-AS1轉(zhuǎn)錄本重疊約664個(gè)核苷酸（圖8A）。換句話說，ELF3-AS1可以與ELF3-201的第一外顯子區(qū)結(jié)合形成雙鏈RNA分子。另一方面，RNA-seq分析表明，與ELF3-203或任何其他ELF3轉(zhuǎn)錄本水平相比，ELF3-AS1的敲低對(duì)ELF3-201表達(dá)的影響更深遠(yuǎn)（圖8B）。這些數(shù)據(jù)暗示ILF2 / ILF3復(fù)合物可能與ELF3-AS1和ELF3-201形成的dsRNA結(jié)合。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種可能性，作者還檢查了ILF2 / ILF3的RIP測(cè)定中的ELF3-201轉(zhuǎn)錄本水平。與ILF2和ILF3結(jié)合的ELF3-201轉(zhuǎn)錄本遠(yuǎn)高于對(duì)照IgG組（圖8C，D），表明ILF2 / ILF3復(fù)合物可以與ELF3-AS1和ELF3-201形成的dsRNA結(jié)合。

據(jù)報(bào)道，ILF2/ILF3復(fù)合物在調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性中起重要作用。RNA-seq數(shù)據(jù)和qPCR檢測(cè)表明，ILF3的敲低顯著降低了ELF3-AS1和ELF3-201的mRNA水平，而ILF2的敲低顯著提高了ELF3-AS1和ELF3-201的mRNA水平（圖8E-G）。這些結(jié)果表明，ILF2和ILF3蛋白對(duì)ELF3-AS1轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性具有相反的影響。先前的一項(xiàng)研究報(bào)道，NF45在ILF2/ILF3復(fù)合物中作為調(diào)節(jié)亞基起作用。有趣的是，作者還注意到ILF2的敲低可能會(huì)影響ILF3基因的選擇性剪接（圖8H）。因此，推測(cè)ILF2可能通過影響ILF3基因的選擇性剪接來調(diào)控ELF3-AS1和ELF3-201的表達(dá)。

圖8 ILF2/ILF3與ELF3-AS1/ELF3 RNA雙鏈體相互作用，影響RNA雙鏈體的穩(wěn)定性

結(jié)論：

綜上所述，在GC中發(fā)現(xiàn)了SNAI2和lncRNA ELF3-AS1之間新的雙負(fù)反饋環(huán)。SNAI2-ELF3-AS1反饋環(huán)通過連續(xù)激活SNAI2信號(hào)傳導(dǎo)并在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)ELF3表達(dá)來驅(qū)動(dòng)GC轉(zhuǎn)移。在GC中，SNAI2過表達(dá)，導(dǎo)致ELF3和ELF3-AS1的表達(dá)水平降低。反過來，ELF3-AS1下調(diào)通過持續(xù)激活SNAI2信號(hào)傳導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞增殖進(jìn)一步推動(dòng)腫瘤進(jìn)展，從而導(dǎo)致GC預(yù)后不良。

參考文獻(xiàn)：

Li D, Shen L, Zhang X, Chen Z, Huang P, Huang C, Qin S. LncRNA ELF3-AS1 inhibits gastric cancer by forming a negative feedback loop with SNAI2 and regulates ELF3 mRNA stability via interacting with ILF2/ILF3 complex. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Dec 2;41(1):332. doi: 10.1186/s13046-022-02541-9.