教你如何分析多組學(xué)文章
近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組和代謝組的聯(lián)合分析得到了廣泛的應(yīng)用，成為鑒定許多與生物表型性狀相關(guān)的關(guān)鍵基因和代謝物的有力工具。為此，有研究通過(guò)整合代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析，研究了5個(gè)不同顏色茄子品種的特征性代謝組分和候選調(diào)控基因。通過(guò)加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)得到類(lèi)黃酮合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和一些新的關(guān)鍵基因。這一發(fā)現(xiàn)不僅對(duì)類(lèi)黃酮合成的分子網(wǎng)絡(luò)提供了新的見(jiàn)解，而且為未來(lái)茄子的分子育種提供了有價(jià)值的信息。該研究2022年11月發(fā)表在《international Journal of Molecular Sciences》，IF：6.2。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. 果皮顏色與總花青素和葉綠素含量的變化
研究中使用的5個(gè)品種：A1和A3的果皮為黑紫色，但花萼顏色不同，A2的果皮為綠色，A4的果皮為白色，A5的果皮為紅紫色(圖1A)。A1(黑紫)、A2(綠色)、A3(黑紫)、A4(白色)、A5(紅紫)的明度值(L*)分別為24.21、53.75、24.61、89.47、33.05。黑紫色品種A1和A3的明度值最低。也就是說(shuō)，A1和A3的果皮顏色比其他品種更深。紅度值(a*)在?20.54 ~ 27.23之間，其中A5紅度值最高，果皮呈紅紫色。黃度參數(shù)(b*)范圍為?8.55 ~ 37.88，其中果皮為綠色的A2黃度值最高(圖1B)。測(cè)定了5個(gè)品種的總花青素和葉綠素含量?；ㄇ嗨乜偤恳?/span>A1最高，其次是A3和A5，而A2和A4的花青素總含量顯著較低(圖1C)。A2的葉綠素總含量略高于A1和A3。在A4和A5中檢測(cè)到的總?cè)~綠素量非常低(圖1D)。總花青素和葉綠素含量均以A4最低?？傮w上，果皮顏色值和色素含量與果皮顏色變化趨勢(shì)一致。
圖1 5個(gè)不同果色茄子品種的表型
2. 類(lèi)黃酮代謝差異
基于LC-MS/MS對(duì)彩色茄子果實(shí)中的黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行了廣泛的靶向代謝物分析。共鑒定出260種黃酮類(lèi)代謝物，包括花青素32種、查爾酮10種、黃烷醇5種、黃酮25種、黃烷醇11種、黃酮58種、黃酮碳苷11種、黃酮醇86種、異黃酮10種、原花青素A6和單寧11種。層次聚類(lèi)分析(HCA)展示五個(gè)茄子品種的相對(duì)含量的表型變異(圖2A)。共鑒定出32種花青素，其中飛燕草苷10種、矢車(chē)菊苷14種、牽?；ㄜ?/span>3種、馬爾維甲苷2種、杜鵑花苷2種、天竺葵苷1種。5個(gè)茄子品種中鑒定出的花青素的相對(duì)含量差異很大(圖2B)。在綠色和白色果皮的A2和A4中均未檢測(cè)到飛燕草苷、牽牛花苷和馬爾維定苷。在紅色至深紫色組(A1、A3和A5)已鑒定的花青素中，A1和A5中含量最高的是D3R、del-3-O-(2-O-p-coumaroyl)rutinoside-7-O-glu和del-3-O-(2-O-p-coumaroyl)rutinoside-5-O-glu (nasunin)。有趣的是，D3R和nasunin是紫茄子中最具代表性的花青素化合物，在A3中沒(méi)有檢測(cè)到，而del-3-O-(6-O-p-coumaroyl)glu和cya-3-O-(6-O-p-coumaroyl)glu的含量在A3中最高?？傮w上，已鑒定的花青素在A1中含量最高，其次是A3和A5。在本研究中，5個(gè)品種之間的黃酮類(lèi)代謝產(chǎn)物存在顯著差異。檢測(cè)到以鼠李糖、半乳糖、蘆丁糖和葡萄糖為主要糖配體的各種類(lèi)黃酮苷。其中，山奈酚、槲皮素、楊梅素、木犀草素及其衍生物是茄子中主要的黃酮醇和黃酮。黃酮類(lèi)化合物在A4中積累最多，含量最低，其次是A2。在紅-黑-紫組(A1、A3和A5)中，A1和A5的類(lèi)黃酮積累模式與A3更為相似。通常情況下，大多數(shù)查爾酮，單寧和黃酮醇在A3中的含量高于A1和A5。主成分分析來(lái)說(shuō)明5個(gè)品種中多個(gè)變量的內(nèi)部結(jié)構(gòu)(圖3)。在PCA圖中，質(zhì)量控制(QC)樣本被分組在一起，表明分析的穩(wěn)定性和重復(fù)性。與HCA結(jié)果一致，A1和A5在圖中距離較近，表明其代謝積累模式相似。雖然A1和A5聚在一起較近，但5個(gè)品種可以很容易區(qū)分。
3. 5個(gè)茄子品種代謝產(chǎn)物積累差異的比較
建立正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)評(píng)分圖，分析5個(gè)品種的兩兩差異。高可預(yù)測(cè)性以及5個(gè)品種間兩兩比較OPLS-DA模型的擬合優(yōu)度(R2X和R2Y)較強(qiáng)(圖4)，說(shuō)明代謝數(shù)據(jù)的可靠性。雖然在PCA圖中A1和A5相互靠近，但在OPLS-DA模型中，A1、A2、A3、A4和A5明顯分開(kāi)，表明不同果皮顏色組之間的黃酮類(lèi)化合物代謝譜存在主要差異。采用差異倍數(shù)≥2或≤0.5和VIP (variable importance in project)≥1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行兩兩比較，進(jìn)一步確定差異累積的代謝物(dam)。與果皮顏色為白色的A4相比，A1(黑紫色)、A2(綠色)、A3(黑紫色)、A5(紅紫色)分別鑒定出156、101、145、150只母鼠(圖5A)。正如預(yù)期的那樣，隨著果皮顏色從白色變成黑紫色，其他4個(gè)品種的大多數(shù)水壩都上調(diào)了。在A4 vs. A1、A4 vs. A2、A4 vs. A3和A4 vs. A5比較組中，共觀察到48只母鼠(圖5B)。在紅色到黑紫色組(A1 vs A3, A1 vs A5, A3 vs A5)中，A1 vs A5的dam數(shù)量最少(A5中上調(diào)46個(gè)，下調(diào)32個(gè))。與A3相比，A1和A5分別觀察到146個(gè)dam(105個(gè)下調(diào)和41個(gè)上調(diào))和143個(gè)dam(99個(gè)下調(diào)和44個(gè)上調(diào))(圖5A)。大多數(shù)的水壩，包括查爾酮，黃烷醇，黃酮醇和單寧，在A3上調(diào)。
將5個(gè)品種之間的差異代謝產(chǎn)物映射到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，并對(duì)每個(gè)對(duì)照組的dam進(jìn)行KEGG富集分析。所有對(duì)照組中檢測(cè)到的最豐富的途徑是類(lèi)黃酮生物合成、花青素生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、異類(lèi)黃酮生物合成和次生代謝產(chǎn)物生物合成。
圖3 5個(gè)茄子品種類(lèi)黃酮譜的PCA評(píng)分圖
圖4 比較組的正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)模型
圖5 5個(gè)茄子品種的類(lèi)黃酮差異分析
4.五個(gè)茄子品種果皮的比較轉(zhuǎn)錄組
5個(gè)品種共建立15個(gè)文庫(kù)，每個(gè)品種3個(gè)生物重復(fù)。去除適配器和低質(zhì)量序列后，每個(gè)品種共獲得20.66~21.4 Gb的清潔讀長(zhǎng)。每個(gè)文庫(kù)的Q20和Q30值分別等于或大于97.43和92.92%(表1)。這些干凈的reads被映射到參考基因組，匹配率在96.64~ 97.91%。以log2比值表達(dá)變化倍數(shù)≥1且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率≤0.01為閾值鑒定差異表達(dá)基因(DEGs)，在所有樣本中共獲得10110個(gè)DEGs。比較組分別有4265、3987、4005、4253、3837、3629、4456、4095、2881和2152個(gè)DEGs，包括A1 vs. A2、A1 vs. A3、A1 vs. A5、A2 vs. A5、A3 vs. A5、A4 vs. A1、A4 vs. A2、A4 vs. A3、A4 vs. A5(表2)。在這些比較組中，A4 vs. A5組的上調(diào)和下調(diào)DEGs數(shù)量最少。對(duì)這些DEGs進(jìn)行GO富集分析顯示，與“細(xì)胞”、“細(xì)胞部分”和“細(xì)胞器”相關(guān)的基因在細(xì)胞成分類(lèi)別中占主導(dǎo)地位。在分子功能類(lèi)別中，富集最多的項(xiàng)是結(jié)合和催化活性。在生物過(guò)程類(lèi)別中，基因主要參與代謝和細(xì)胞過(guò)程。KEGG注釋結(jié)果顯示，所有樣本的DEGs共映射到141條KEGG通路，其中次級(jí)代謝物生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙素生物合成、類(lèi)黃酮生物合成、花青素生物合成、光合作用、光合-天線蛋白、卟啉和葉綠素代謝等KEGG通路顯著富集。
5. 參與類(lèi)黃酮生物合成的DEGs的鑒定
為了探索不同果皮顏色茄子中黃酮類(lèi)物質(zhì)的積累機(jī)制，分析了苯丙素和黃酮類(lèi)物質(zhì)通路中涉及的基因表達(dá)模式。正如預(yù)期的那樣，大部分參與類(lèi)黃酮生物合成的結(jié)構(gòu)基因，包括PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT，在A2和A4中轉(zhuǎn)錄水平顯著較低，這可能是A2和A4中類(lèi)黃酮水平較低的原因之一(圖6)。F3。wH在A2和A4中沒(méi)有或非常弱的表達(dá)水平，這表明F3thaH可能是直接決定茄子果皮紫色的關(guān)鍵因素。
在A1與A3、A1與A5、A3與A5比較組中，類(lèi)黃酮生物合成途徑相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因也存在差異表達(dá)。在A1與A5和A3與A5的比較中，A5的早期和晚期生物合成基因均下調(diào)，包括PAL、4CL、C4H、CHS、CHI、F3H、F3 3HH、DFR、ANS和UFGT。值得注意的是，在A1和A3的比較中，早期生物合成基因包括CHS、CHI、F3H和F3nd H沒(méi)有差異表達(dá)，大部分DEGs是晚期生物合成基因，如DFR、ANS和花青素修飾基因(Smechr0502047、Smechr0400421和Smechr1102789)。
總體而言，在黑紫色果皮的A1和A3中，大部分參與類(lèi)黃酮生物合成的結(jié)構(gòu)基因均高表達(dá)。隨著紫色的降低，A5中黃酮基因表達(dá)量下降，A2和A4表達(dá)量最低。
圖6 花青素/類(lèi)黃酮通路相關(guān)基因的表達(dá)譜
茄子果皮的綠色主要受葉綠素的影響。在這項(xiàng)研究中,共計(jì)27度與葉綠素代謝被確定(圖7)。A2綠色水果皮相比,大多數(shù)的度顯示低表達(dá)在A4和A5, (Smechr0402030和Smechr0100518),包括宋春芳HEMC (Smechr0702754)、血紅素(Smechr0400257和Smechr0601135), HEMF (Smechr0400064) HEMG (Smechr0102139) CHLH (Smechr0400430) CHLM (Smechr0303264), CRD (Smechr1002947)、運(yùn)動(dòng)(Smechr0702049), DVR (Smechr0100030),曹(Smechr0601739和Smechr1200635),NOL (Smechr0701042)和HCAR (Smechr0902459)。
圖7 葉綠素代謝途徑相關(guān)基因的差異表達(dá)
7. 參與激素介導(dǎo)信號(hào)通路的DEGs的鑒定
KEGG富集分析顯示，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是富集最顯著的通路之一。在生長(zhǎng)素信號(hào)通路中，5個(gè)DEGs的表達(dá)水平與顏色變化相關(guān)，包括AUX/IAA (Smechr0303465)、ARF (Smechr0101326)、GH3 (Smechr0400187)和SAUR (Smechr0100144和Smechr1100127)。在赤霉素信號(hào)通路中，GID1 (Smechr1000150)和DELLA (Smechr0500162和Smechr0500354)的表達(dá)與果皮顏色變化呈正相關(guān)。與乙烯信號(hào)通路相關(guān)的基因ETR (Smechr0902323)和EBF1/2 (Smechr0700262和Smechr1200241)以及與BR信號(hào)通路相關(guān)的基因BRI1 (Smechr0702406)和BKI1 (Smechr0502339)的表達(dá)與5個(gè)品種的顏色變異相關(guān)。ABA信號(hào)通路中的ABF (Smechr0100651)和SnRK2 (Smechr0401004和Smechr0802058)在黑紫色果皮的A1和A3中表達(dá)量較高。同時(shí)，SA信號(hào)通路中TGA (Smechr1002700)的表達(dá)與5個(gè)品種的顏色變異具有相關(guān)性。具體而言，參與JA信號(hào)通路的兩個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子在5個(gè)品種中表達(dá)水平不同，其中SmTT8 (Smechr0901701)也參與類(lèi)黃酮的生物合成(補(bǔ)充圖S2)。
8. 共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵候選基因的鑒定
為了研究茄子果實(shí)果皮著色的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使用6241個(gè)非冗余DEGs進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)，得到了20個(gè)不同顏色標(biāo)記的模塊(圖8)。以總花青素含量和總?cè)~綠素含量以及飛葵素型花青素作為表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。分析表明，紫模塊和紫模塊分別與花青素含量和葉綠素含量呈正相關(guān)(圖9A)。分組到不同模塊的基因KEGG富集分析顯示，紫色模塊的基因富集于類(lèi)黃酮生物合成，而紫色模塊的基因富集于光合-天線蛋白、卟啉和葉綠素代謝。在紫色模塊的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中，四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子SmGL2 (Smechr0303487)、SmGATA26 (Smechr0601814)、SmWRKY44 (Smechr1002420)和SmTT8 (Smechr0901701)以及連接度最高的類(lèi)黃酮生物合成通路相關(guān)基因SmF3mFtH (Smechr1201797)、SmUFGT (Smechr1002540)、SmPAL (Smechr0500713)和Sm4CL (Smechr0302347)被確定為樞紐基因(表3，圖9B)。SmWRKY44和SmTT8已被報(bào)道參與花青素的生物合成。因此，為了進(jìn)一步研究SmGL2和SmGATA26的功能，構(gòu)建TRV2-SmGL2, TRV2-SmGATA26和TRV2-SmWRKY44重組體來(lái)沉默茄子紫色皮中的SmGL2, SmGATA26和SmWRKY44。與TRV2相比，沉默SmGL2、SmGATA26和smwrky44的茄子果皮中的花青素積累減少，表明SmGL2和SmGATA26可能參與花青素的生物合成(圖9C)。
圖8 層次聚類(lèi)呈現(xiàn)20個(gè)共表達(dá)基因的模塊
圖9花青素合成相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵候選基因的鑒定
9. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)差異表達(dá)基因的驗(yàn)證
為驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，選取16個(gè)差異表達(dá)基因(包括8個(gè)hub基因)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)分析。如圖10所示，qRT-PCR結(jié)果顯示這些基因的表達(dá)模式與RNA-seq結(jié)果一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠。
圖10 5個(gè)茄子品種中16種DEGs的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析