開(kāi)眼界了——腸道短鏈脂肪酸通過(guò)NLRP3緩解房顫
研究顯示不良的腸道菌群（GM）和NLRP3炎癥小體是心房顫動(dòng)（AF）的促心律失常因素。其中，轉(zhuǎn)基因膳食纖維發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸（SCFA）是否可作為隱形介質(zhì)尚不清楚。因此，本研究旨在確定SCFA緩解NLRP3信號(hào)介導(dǎo)的心房重構(gòu)是否保護(hù)房顫的發(fā)展。作者基于GC-MS代謝組學(xué)的橫斷面研究在48個(gè)人中探索糞便SCFA水平和AF性狀之間的關(guān)系，并最終證實(shí)由腸道共生菌發(fā)酵的膳食纖維衍生的SCFA可通過(guò)GPR43/NLRP3信號(hào)緩解房顫的發(fā)展。本研究于2022年6月發(fā)表在《International Journal of Biological Sciences》IF：10.750期刊上。
技術(shù)路線：
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
盡管根據(jù)之前的宏基因組分析，已經(jīng)在AF患者中發(fā)現(xiàn)SCFA合成相關(guān)基因的中斷，其特征是酶基因和隱藏物種的減少，但尚未獲得AF患者中SCFA的實(shí)際水平。因此，本研究通過(guò)GC-MS定量測(cè)定了24名AF患者和24名匹配的健康人(CTR)的糞便中SCFA的水平。結(jié)果顯示與CTR比較，AF患者糞便中SCFA的水平下降（圖1B）。有趣的是，在進(jìn)展型房顫中，從非房顫對(duì)照、陣發(fā)性房顫(PAF)、<12個(gè)月持續(xù)性房顫(psAF)和>12個(gè)月的psAF中觀察到SCFA水平的持續(xù)下降趨勢(shì)（圖1C）。隨后分析SCFA與左心房前后徑（LAD）的相關(guān)性，結(jié)果顯示為負(fù)相關(guān)（圖1D）。以上結(jié)果表明SCFA缺失和AF進(jìn)展緊密相關(guān)。
圖1 房顫患者糞便中SCFA水平減少
2、膳食纖維改變GM結(jié)構(gòu)和SCFA產(chǎn)生
為確定從腸道食物中提取的SCFA對(duì)房顫的影響，分別喂給小鼠正常(5%纖維素)、低(1%纖維素)和高(5%纖維素+5%菊粉)纖維素飼料4周，隨后16S rRNA測(cè)序結(jié)果表明，低纖維素組的GM多樣性顯著高于另外兩組（圖2A），同時(shí)伴隨著整體腸道菌群組成分類的改變（圖2B-D）。此外，圖2E量化了3組中糞便SCFA的水平結(jié)果顯示在低纖維組中最低。這些結(jié)果表明膳食纖維改變了GM組成結(jié)構(gòu)和SCFA的產(chǎn)生。
圖2膳食纖維改變轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)和短鏈脂肪酸的生成
3、膳食纖維來(lái)源的SCFA的缺乏會(huì)改變左心房的生理指標(biāo)
為檢測(cè)膳食纖維來(lái)源的SCFA對(duì)心房電傳導(dǎo)及心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響，分別對(duì)四組大鼠進(jìn)行體表心電圖(ECG)和經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢查。提取II號(hào)導(dǎo)聯(lián)的波形（圖3A），反映心房-心室結(jié)和左心室傳導(dǎo)功能的心率、PR間期和QRS持續(xù)時(shí)間，結(jié)果表明這些指標(biāo)在四組中相似（圖3B）。值得注意的是，P波持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)是無(wú)序和混亂心房電傳導(dǎo)的有力指標(biāo)，在低纖維飲食喂養(yǎng)的小鼠中被檢測(cè)到，這種現(xiàn)象可以通過(guò)補(bǔ)充SCFA來(lái)逆轉(zhuǎn)（圖3B）。此外，P波持續(xù)時(shí)間與SCFA水平呈負(fù)相關(guān)（圖3C）。超聲心動(dòng)圖（圖3D）顯示低纖維飲食組左心房直徑增加，射血分?jǐn)?shù)受損，但在高纖維飲食或補(bǔ)充SCFA的小鼠中沒(méi)有（圖3E）。這些發(fā)現(xiàn)為膳食纖維衍生的SCFA可能參與心房重構(gòu)提供了初步證據(jù)。
圖3膳食纖維來(lái)源的SCFA的缺乏會(huì)改變左心房的生理指標(biāo)
4、缺乏膳食纖維來(lái)源的SCFA會(huì)增加房顫的易感性
為評(píng)價(jià)喂養(yǎng)不同類型膳食纖維的小鼠的房顫誘發(fā)性和持續(xù)時(shí)間，采用經(jīng)食管爆發(fā)性起搏實(shí)驗(yàn)。因此，在基線時(shí)，兩組均未觀察到房性心律失常發(fā)作，burst起搏后的代表性心電圖如圖4A、4B所示。Burst起搏誘發(fā)低纖維小鼠AF發(fā)生率為9/30(30.00%)，高纖維小鼠AF發(fā)生率為2/30 (6.67%)，SCFA補(bǔ)充小鼠AF發(fā)生率為1/30 (3.33%)（圖4C）?？傊?，低纖維飲食小鼠的AF發(fā)生率高于對(duì)照組，遠(yuǎn)高于高纖維飲食組和SCFA補(bǔ)充組（圖4D）。這些結(jié)果缺乏膳食纖維會(huì)增加房顫的易感性，而SCFA則發(fā)揮了部分保護(hù)作用。
圖4缺乏膳食纖維來(lái)源的SCFA會(huì)增加房顫的易感性
5、缺乏膳食纖維來(lái)源的SCFA會(huì)加劇心房傳導(dǎo)紊亂
電重構(gòu)促進(jìn)了AF的電生理底物—易再入環(huán)境，這是由離子通道功能障礙、間隙連接分布中斷，連接素半通道蛋白Cx43和N-cadherin的共定位丟失造成的。在正常和高纖維飼糧組中，Cx43和N-cadherin縫隙連接位于細(xì)胞末端，幾乎沒(méi)有左右連接（圖5A）。相反，在低纖維組中，Cx43和N-cadherin的分布模式明顯改變，而在SCFA補(bǔ)充組則有所改善介于兩者之間（圖5A）。此外，WB結(jié)果表明，補(bǔ)充SCFA可以防止膳食纖維缺乏介導(dǎo)的Ca2+處理中斷，其特征是上調(diào)心房中磷酸化的CaMKII和CaMKII相關(guān)的RyR2的磷酸化表達(dá)水平（圖5B）。這些結(jié)果表明，膳食纖維來(lái)源的SCFA對(duì)心房Cx43/N-cadherin定位和CaMKII介導(dǎo)的RyR2磷酸化具有保護(hù)作用，這可能與心房電底物的穩(wěn)定性有關(guān)。
圖5缺乏膳食纖維來(lái)源的SCFA會(huì)加劇心房傳導(dǎo)紊亂
心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，主要包括組織纖維化，與傳導(dǎo)異常相關(guān)，為房顫維持創(chuàng)造基質(zhì)。Masson和天狼星紅染色顯示，低纖維飲食小鼠心房組織纖維化紊亂和膠原蛋白表達(dá)顯著進(jìn)展，補(bǔ)充SCFA可緩解纖維化和膠原蛋白表達(dá)紊亂（圖6A）。這一現(xiàn)象與一些纖維化相關(guān)標(biāo)志物的蛋白水平一致，如I型膠原、TGF-β和α-SMA（圖6B）。綜上所述，這些結(jié)果部分解釋了膳食纖維來(lái)源的SCFA、異源性心房傳導(dǎo)和房顫易感性之間的病理生理過(guò)程。
圖6缺乏膳食纖維來(lái)源的SCFA會(huì)加重心房纖維化
6、SCFA可減輕低纖維飲食小鼠NLRP3的激活
近年來(lái)的研究通過(guò)SCFA在不同組織和細(xì)胞類型中的傳感器GPR43對(duì)其抗炎特性進(jìn)行了深入的研究。因此，作者假設(shè)SCFA對(duì)NLRP3炎癥小體激活具有保護(hù)作用。首先，在低纖維組心房中檢測(cè)到高水平的NLRP3、pro-caspase-1、cleaved caspase-1和IL-1β（圖7A），表明低纖維飲食與NLRP3激活之間存在相關(guān)性，盡管其潛在機(jī)制尚未闡明。接下來(lái)，在高纖維組或SCFA補(bǔ)充組小鼠心房組織中發(fā)現(xiàn)自噬降解和失活指標(biāo)K48-和k63-連接的泛素化增加，提示SCFA可能對(duì)NLRP3激活有緩解作用（圖7B）。此外，在高纖維組和SCFA補(bǔ)充組中，觀察到SCFA的天然傳感器GPR43蛋白水平上調(diào)（圖7A），這表明GPR43的調(diào)控作用需要進(jìn)一步研究?？傊?，這些初步結(jié)果描述了膳食纖維衍生的SCFA通過(guò)K48和k63連接的泛素化自噬降解阻止通過(guò)GPR43激活NLRP3炎癥小體的可能作用，從而對(duì)AF發(fā)揮保護(hù)作用。
圖7富含膳食纖維衍生的SCFA可通過(guò)GPR43信號(hào)減弱NLRP3的激活
7、在HL-1細(xì)胞中SCFA通過(guò)的GPR43信號(hào)通路減弱炎癥小體激活和相關(guān)心房重構(gòu)
為進(jìn)一步探討SCFA對(duì)NLRP3激活的抑制作用，在奈革霉素刺激前先用SCFA處理LPS介導(dǎo)的HL-1細(xì)胞，隨后，測(cè)定HL-1細(xì)胞中NLRP3、pro-caspase-1、cleaved caspase-1和IL-1β的蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCFA抑制了LPS/nigicin誘導(dǎo)的IL-1β的產(chǎn)生和caspase-1的激活（圖8A）。接下來(lái)，分析SCFA介導(dǎo)NLRP3抑制的機(jī)制。本研究中，先前發(fā)現(xiàn)SCFA促進(jìn)了HL-1細(xì)胞中K48-和k63-連接泛素鏈的GPR43表達(dá)和泛素化。此外，在HL-1細(xì)胞中，當(dāng)GPR43介導(dǎo)的NLRP3失活減弱炎癥小體激活時(shí)，可以觀察到CaMKII磷酸化的緩解（圖8A）。然而，在LPS和奈日菌素刺激前，用siGPR43處理的細(xì)胞中，SCFA對(duì)炎癥小體的這些作用減弱（圖8B）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明SCFA通過(guò)GPR43和CaMKII調(diào)控NLRP3炎癥小體的激活，初步揭示了SCFA介導(dǎo)NLRP3炎癥小體衰減的潛在機(jī)制。
圖8在HL-1細(xì)胞中SCFA通過(guò)GPR43信號(hào)通路減弱NLRP3激活
總之，本研究證實(shí)腸道共生微生物發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生的SCFA通過(guò)GPR43/NLRP3信號(hào)緩解房顫的發(fā)展。目前的研究結(jié)果證明，SCFA激活心房GPR43是一種有前途的房顫治療策略。
參考文獻(xiàn)：
Zuo Kun., Fang Chen., Liu Zheng., Fu Yuan., Liu Ye., Liu Lifeng., Wang Yuxing., Yin Xiandong., Liu Xiaoqing., Li Jing., ZhongJiuchang., Chen Mulei., Xu Li., Yang Xinchun.(2022). Commensal microbe-derived SCFA alleviates atrial fibrillation via GPR43/NLRP3 signaling. Int J BiolSci, 18(10), 4219-4232. doi:10.7150/ijbs.70644