類風濕關(guān)節(jié)炎中基于m6A甲基化調(diào)節(jié)因子的診斷基因標簽和異常通路激活

類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性自身免疫性疾病，其特征是滑膜組織腫瘤樣增生，持續(xù)性滑膜炎癥，骨侵蝕和進行性關(guān)節(jié)破壞。類風濕性關(guān)節(jié)炎通常發(fā)生在中年女性中。目前，RA的發(fā)展歸因于遺傳和環(huán)境因素，如吸煙，肥胖，壓力，神經(jīng)抑郁和女性荷爾蒙。RA患者發(fā)生惡性腫瘤的風險高于一般人群。最近，RA患者的臨床癥狀和并發(fā)癥的管理越來越受到醫(yī)務(wù)工作者的關(guān)注。深入了解RA發(fā)生和發(fā)展的機制有助于及早發(fā)現(xiàn)RA及其并發(fā)癥，以便采取措施控制疾病的發(fā)展并減少疾病的活動。該研究發(fā)表于《Frontiers in Immunology》，IF：8.786。

技術(shù)路線：

研究示意圖：

圖1 研究示意圖

主要研究結(jié)果：

1. 使用m6A調(diào)節(jié)器的RA分類方法的性能

考慮到m6A甲基化調(diào)節(jié)劑在腫瘤和免疫疾病進展中的重要作用，作者使用公共數(shù)據(jù)集全面探討了19種m6A甲基化調(diào)節(jié)劑對RA診斷的重要性?；谶@19種m6A甲基化調(diào)節(jié)因子的表達水平，使用五種不同的機器學習方法構(gòu)建了疾病診斷模型（RA與非RA）：使用Boruta，Rpart，LASSO，XGBoost和邏輯回歸的隨機森林優(yōu)化。除Rpart模型外，所有模型的精度和AUC均大于0.8。為了比較每種機器學習方法的性能，作者觀察了每個模型作為驗證集中分類器的性能。驗證集中每種機器學習方法的性能也是可變的（圖2A-F）。在驗證數(shù)據(jù)集1中，邏輯回歸模型和LASSO_λ-min 模型的 AUC 最高（0.90），但 LASSO_λ-min 模型的準確度更高（0.901）。Rpart模型的AUC最低（0.8）。在驗證數(shù)據(jù)集2中，LASSO_λ-min 模型和 LASSO_λ-1se 模型的準確度最高（0.89）和 AUC（0.88）。在這些模型中，Rpart模型的性能最差。此外，每種機器學習方法選擇的m6A甲基化調(diào)節(jié)劑數(shù)量不同，Boruta選擇最多（14個調(diào)節(jié)劑），Rpart模型僅選擇一個調(diào)節(jié)劑。考慮到每種機器學習方法在驗證集中的性能及其在模型中選擇的調(diào)節(jié)器數(shù)量，LASSO_λ-1se模型不僅在驗證集中表現(xiàn)更好，而且在變量篩選方面也表現(xiàn)出更嚴格的要求。這些結(jié)果表明，LASSO_λ-1se模型具有良好的臨床應(yīng)用價值和實用性。因此，作者進一步比較了LASSO_λ-1se模型在全血樣品中的性能，并計算出AUC值為0.83（圖2G），進一步提示LASSO_λ-1SE模型在基于血液的RA診斷中具有臨床應(yīng)用前景。

圖2 驗證集1和驗證集2的ROC曲線，模型在單獨的集上訓練

2. RA分類中更重要的m6A甲基化調(diào)節(jié)劑

通過這些多變量機器學習方法選擇不同的候選生物標志物。然而，生物標志物通常具有相同的準確性和重要性。考慮到Rpart模型的性能最差，作者專注于不同機器學習方法選擇的重疊m6A甲基化調(diào)節(jié)因子，包括使用Boruta，LASSO，XGBoost和邏輯回歸（圖3A）。每種型號都選擇了兩種重疊的m6A甲基化調(diào)節(jié)劑：IGF2BP3和YTHDC2。在訓練數(shù)據(jù)集中進一步比較了19 m6A甲基化調(diào)節(jié)劑的表達水平。IGF2BP3和YTHDC2在RA和非RA患者中的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（圖3B）。更重要的是，基于轉(zhuǎn)錄水平，IGF2BP3和YTHDC2在訓練集中的RA診斷中也表現(xiàn)良好（圖3C），AUC值分別為0.85和0.75。此外，當Boruta（圖3D）、Rpart（圖3E）和XGBoost（圖3F）算法計算了19 m6A甲基化調(diào)節(jié)劑的重要性，IGF2BP3和YTHDC2排名較高；IGF2BP3 具有最高的重要性。

圖3 在RA分類中比較重要的m6A甲基化調(diào)節(jié)劑

3. IGF2BP3在RA-FLS的活力和細胞周期中的重要性

根據(jù)途徑富集分析結(jié)果，IGF2BP3和YTHDC2與細胞周期密切相關(guān)。但是，當Boruta（圖3D）、Rpart（圖3E）和XGBoost（圖3F）算法計算了19 m6A甲基化調(diào)節(jié)因子的重要性，IGF2BP3排名第一，YTHDC2排名較低。此外，與YTHDC2相比，IGF2BP3對RA的診斷效能更好（圖3C）。因此，作者通過分子生物學實驗進一步探討了IGF2BP3對RA-FLSs活力和細胞周期的調(diào)控作用。為了探索IGF2BP3對RA-FLS的影響，將siRNA轉(zhuǎn)染到RA-FLS中。RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡法證實了轉(zhuǎn)染結(jié)果，表明siRNA具有良好的敲低效率（圖4B-D）。然后，作者研究了IGF2BP3對體外RA-FLS活力的影響。CCK-8細胞毒性測定顯示，與對照細胞相比，RA-FLS中IGF2BP3的下調(diào)顯著降低了細胞活力（P<0.05，圖4E）。細胞增殖測定還顯示，與對照細胞相比，RA-FLS中IGF2BP3的下調(diào)顯著抑制了細胞增殖（P<0.05，圖4F）。此外，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，IGF2BP3的低表達對G2/M通道有明顯影響。與對照組相比，siIGF2BP3組G2/M期細胞比例顯著增加（P<0.05，圖4G，H）。作者還測量了細胞周期相關(guān)蛋白的表達，表明siIGF2BP3降低了CCNB1和C-MYC的表達（圖4C，D）。此外，檢測OA（osteoarthritis）和RA患者滑膜組織中IGF2BP3的表達。作者發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜組織中IGF2BP3表達顯著較高，進一步證實了 IGF2BP3 在 RA 進展中的重要性（圖4I）

圖4 IGF2BP3在RA-FLS的活力和細胞周期中的重要性

4. IGF2BP3表達與炎癥活性的相關(guān)性

為了鑒定RA中IGF2BP3相關(guān)的免疫特征，作者用xCell確定了免疫評分和免疫細胞的比例。首先，作者發(fā)現(xiàn)兩組之間的免疫評分差異有統(tǒng)計學意義，RA患者組的免疫評分高于NC患者組（P<0.001；圖5A）。然后，比較兩組免疫細胞的比例。許多免疫細胞的比例存在顯著差異，包括指間細胞（IDC）、自然殺傷T（NKT）細胞、經(jīng)典樹突狀細胞（cDC）、巨噬細胞、肥大細胞、M2巨噬細胞、Th2細胞、M1巨噬細胞和肌細胞（圖5B，C）。在這些細胞類型中，作者專注于M1巨噬細胞，因為M1巨噬細胞與RA之間存在密切關(guān)系。RA患者M1巨噬細胞比例顯著高于對照患者。此外，作者研究了類風濕性關(guān)節(jié)炎患者M1巨噬細胞比例與IGF2BP3表達水平的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它們具有很強的相關(guān)性（圖5D）。IGF2BP3表達也與M1巨噬細胞標志物的表達顯著相關(guān)，包括IL1A、CD86和TLR2（圖5E-G）。因此，作者認為IGF2BP3可以參與M1巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)。

為了進一步探索IGF2BP3對M1巨噬細胞極化的影響，作者用Igf2bp3-siRNA或NC-siRNA（陰性對照）轉(zhuǎn)染了RAW264.7細胞。通過RT?qPCR和蛋白質(zhì)印跡分析確認了基因沉默的效率，表明siRNA具有良好的敲低效率（圖5H，I）。轉(zhuǎn)染后48小時，用100ng/ml LPS處理RAW264.7細胞24小時。然后，通過流式細胞術(shù)測定M1巨噬細胞表面標志物（CD86）的表達，作者發(fā)現(xiàn)CD86在siIgf2bp3細胞中的表達水平明顯低于siNC細胞（圖5J）。此外，作者進一步檢測了細胞上清液中TNF-a的含量，這表明siIgf2bp3細胞中TNF-a的含量低于siNC細胞（圖5K）。這些結(jié)果進一步驗證了IGF2BP3參與M1巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)。

圖5 IGF2BP3表達與炎癥活性之間的相關(guān)性

5. scRNA-seq揭示了IGF2BP3表達與M1巨噬細胞極化的關(guān)系

為了進一步確定IGF2BP3表達和M1型巨噬細胞極化之間的關(guān)系，我們在GSE159117數(shù)據(jù)集中進行了scRNA-seq。通過統(tǒng)一流形近似和投影（UMAP）分析得到14個細胞簇（圖6A）。SingleR（版本1.8.1）用于鑒定7種細胞類型：B細胞，CD4 T細胞，CD8 T細胞，樹突狀細胞，單核細胞，NK細胞和T細胞（圖6B）。發(fā)現(xiàn)IGF2BP3主要在七種細胞類型（圖6C）。巨噬細胞是來源于單核細胞的主要細胞類型。因此，探討CD86與IGF2BP3在單核細胞中的表達關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CD86和IGF2BP3具有共表達趨勢（圖6D）。然后，作者初步研究了幾種巨噬細胞標志物在單核細胞中的表達。M1巨噬細胞標志物（包括CD86，IL1B，TLR2和TLR4）在單核細胞中顯著上調(diào)，但M2巨噬細胞標志物（包括MSR1，IL10，MMP14和VEGFA）下調(diào)（圖6E）。

圖6 UMAP圖顯示了收集的scRNA-seq細胞樣品的來源

結(jié)論：

該研究首次證實了m6A閱讀器蛋白IGF2BP3對RA進展的影響，并通過生物信息學分析和分子生物學實驗驗證了其生物學功能。該研究為RA的早期診斷和靶向治療提供了新的思路和策略，具有理論創(chuàng)新前景。此外，它還為發(fā)現(xiàn)RA的新標志物和藥物靶點提供了理論支持。

參考文獻：

Geng Q, Cao X, Fan D, Gu X, Zhang Q, Zhang M, Wang Z, Deng T, Xiao C. Diagnostic gene signatures and aberrant pathway activation based on m6A methylation regulators in rheumatoid arthritis. Front Immunol. 2022 Dec 13;13:1041284. doi: 10.3389/fimmu.2022.1041284. PMID: 36582238; PMCID: PMC9793088.