circCsnk1g3和circAnkib1調(diào)控的干擾素反應(yīng)在肉瘤中通過(guò)塑造免疫微環(huán)境促進(jìn)腫瘤發(fā)生
外顯子環(huán)狀RNA（circRNAs）主要產(chǎn)生非編碼RNA，最近已在許多腫瘤中被發(fā)現(xiàn)。然而，它們對(duì)癌癥進(jìn)展的功能貢獻(xiàn)仍然知之甚少。在這里，作者鑒定了在軟組織肉瘤細(xì)胞中表達(dá)的circRNA，并探索circRNA如何在體內(nèi)調(diào)節(jié)肉瘤的生長(zhǎng)。作者發(fā)現(xiàn)circCsnk1g3和circAnkib1通過(guò)形成促腫瘤微環(huán)境來(lái)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，這可能是由于它們能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞外部的促腫瘤因子。因此，circCsnk1g3和circAnkib1可以控制肉瘤細(xì)胞中干擾素相關(guān)基因和促炎因子的表達(dá)，從而引導(dǎo)免疫細(xì)胞募集到腫瘤塊中，從而激活它們。在機(jī)制上，circRNA可能通過(guò)緩沖RIG-I介導(dǎo)的通路激活來(lái)抑制促炎因子，RIG-I是細(xì)胞質(zhì)病毒RNA傳感器。目前的研究結(jié)果表明，靶向特定的circRNA可以增強(qiáng)腫瘤的療效和對(duì)主流療法的免疫應(yīng)答。本研究于2022年11月25日發(fā)表于《nature communication》，IF：17.694。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1、CircAnkib1和circCsnk1g3促進(jìn)肉瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)
為確認(rèn)circRNAs在肉瘤中的表達(dá)和功能作用，作者使用了一個(gè)同基因肉瘤小鼠模型，通過(guò)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞中Trp53和Ccne1基因的遺傳操作，作者產(chǎn)生了p53KOCcne1+細(xì)胞，并使用熒光蛋白標(biāo)記示蹤（dsRED）。隨后，將產(chǎn)生的p53KOCcne1+細(xì)胞接種在生物惰性的3D支架上，并移植到同系受體小鼠的皮下（圖1a）。為確保從RNA - seq中鑒定的circRNAs在肉瘤細(xì)胞中表達(dá)，而不是在腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞中表達(dá)。作者從生長(zhǎng)的腫瘤中分離dsRED標(biāo)記的肉瘤細(xì)胞，并通過(guò)體外RT-qPCR來(lái)評(píng)估circRNAs的表達(dá)（附圖1b）。確定12個(gè)候選circRNAs在肉瘤細(xì)胞中的特異性表達(dá)后，作者評(píng)估了這些候選circRNA在惡性細(xì)胞（p53KOCcne1+）中的表達(dá)是否高于類似的非致瘤細(xì)胞（p53KO間充質(zhì)細(xì)胞）。雖然12個(gè)circRNAs在肉瘤細(xì)胞中的平均表達(dá)量均高于非惡性間質(zhì)細(xì)胞，但其中6個(gè)circRNAs（circCamsap1、circRad23b、circBnc2、circRere、circAnkib1和circCsnk1g3）在肉瘤中顯著上調(diào)（附圖1c）。而且，這6個(gè)circRNAs具有標(biāo)準(zhǔn)circRNA的特征。經(jīng)RT-qPCR分析，作者選擇了三個(gè)頂級(jí)circRNA（circAnkib1、circCsnk1g3和circBnc2）。circAnkib1、circCsnk1g3和circBnc2在小鼠模型中進(jìn)行功能研究（圖1b）。重要的是，這3個(gè)circRNAs的人類類似物不僅在UPS中被檢測(cè)到，而且在其他亞型的軟組織肉瘤中也被檢測(cè)到（圖1c）。
針對(duì)每一個(gè)circRNA，作者設(shè)計(jì)了表達(dá)靶向circRNA繩頭插接連接處的shRNA的慢病毒載體來(lái)敲除它們。重要的是，這些shCircRNAs是專門設(shè)計(jì)的，只與繩頭插接連接的序列雜交，而使線性轉(zhuǎn)錄本不受影響（圖1d，左）。shCircRNA vs shSCR肉瘤細(xì)胞（圖1d，右）的qPCR證實(shí)circRNA的特異性和高效敲低，表明shCircRNA細(xì)胞中環(huán)狀而非線狀RNA表達(dá)減少。由于這些circRNAs在惡性細(xì)胞中顯著上調(diào)，作者推測(cè)它們可能影響腫瘤的發(fā)生過(guò)程。為評(píng)估這種體內(nèi)效果，將p53KOCcne1+肉瘤細(xì)胞（其中circAnkib1、circCsnk1g3和circBnc2的表達(dá)被沉默）移植到同基因免疫功能正常小鼠皮下或肺中生成肉瘤。對(duì)照組皮下腫瘤長(zhǎng)至約1 cm3，20 d后取肺組織。值得注意的是，當(dāng)circCsnk1g3和circAnkib1在肉瘤細(xì)胞中被沉默時(shí)，與對(duì)照組相比，皮下腫瘤的體積顯著減小（圖1e），腫瘤內(nèi)dsRED+腫瘤細(xì)胞的比例降低（圖1F）。此外，當(dāng)同樣的circCsnk1g3和circAnkib1沉默的肉瘤細(xì)胞靜脈注射到尾靜脈時(shí)，它們?cè)诜沃芯憩F(xiàn)出明顯減少的腫瘤細(xì)胞和腫瘤灶數(shù)量（圖1g-h）。circBnc2的沉默僅輕微影響皮下肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖1e），并不影響肺內(nèi)腫瘤負(fù)荷（圖1g）。雖然circAnkib1和circCsnk1g3的沉默對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)有顯著影響，但使用針對(duì)線性異構(gòu)體的shRNA沉默線性Ankib1和Csnk1g3轉(zhuǎn)錄本并不影響腫瘤生長(zhǎng)（圖1i-j）。這些結(jié)果說(shuō)明，來(lái)自同一基因的線性和環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本（共享部分核苷酸序列）在癌癥中可以獨(dú)立發(fā)揮作用。此外，這些數(shù)據(jù)表明CircAnkib1和circCsnk1g3可以促進(jìn)肉瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)。
圖1CircAnkib1和circCsnk1g3促進(jìn)肉瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)
附圖1b
附圖1c
2、circRNAs在腫瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié)干擾素信號(hào)和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)
為探究circCsnk1g3和circAnkib1如何促進(jìn)肉瘤生長(zhǎng)，作者研究這些circRNA在肉瘤細(xì)胞中調(diào)控的腫瘤相關(guān)通路?；蚣患治鲲@示，敲低circAnkib1和circCsnk1g3后，I型和II型干擾素的產(chǎn)生和應(yīng)答相關(guān)的信號(hào)通路上調(diào)（圖2a）。與此一致，作者對(duì)篩選出的基因進(jìn)行RT-qPCR發(fā)現(xiàn)沉默circAnkib1和circCsnk1g3后，腫瘤細(xì)胞中干擾素相關(guān)基因（如Ifit3、Isg15、Ifih1、Oasl2、Irf7等）和促炎細(xì)胞因子（如Cxcl10、Cxcl9、Ccl3和Ccl5）的表達(dá)增加（圖2b）。為驗(yàn)證這些觀察結(jié)果是否可以在蛋白水平得到證實(shí)，作者在circCsnk1g3沉默的細(xì)胞上使用了反相蛋白質(zhì)芯片（RPPA）。隨后進(jìn)行WB驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在circCsnk1g3沉默的肉瘤細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，RPPA上調(diào)了NF κB、干擾素調(diào)節(jié)因子（IRFs）和胰島素受體底物（IRSs）的表達(dá)，這些因子通過(guò)干擾素信號(hào)通路發(fā)揮作用（圖2c）。有趣的是，盡管表達(dá)這些炎癥因子，沉默circCsnk1g3的細(xì)胞表達(dá)的STAT1比對(duì)照細(xì)胞少。這表明circCsnk1g3沉默細(xì)胞中炎癥機(jī)制的激活可能來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)；有趣的是，通路分析顯示細(xì)胞內(nèi)病毒RNA感應(yīng)機(jī)制上調(diào)（圖2a）。同時(shí)，對(duì)照細(xì)胞表達(dá)更多的STAT3和STAT5，其中STAT3是IL - 10和IL - 6誘導(dǎo)信號(hào)的主要中介，而STAT5與抑制抗腫瘤免疫和減少腫瘤對(duì)IFNα刺激的反應(yīng)有關(guān)。此外，WB結(jié)果顯示，在circCsnk1g3和circAnkib1沉默的腫瘤細(xì)胞中，干擾素和炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵信號(hào)元件IRF1和pTBK的表達(dá)增強(qiáng)，與RNA水平的數(shù)據(jù)一致（圖2d）。重要的是，促炎通路的表達(dá)增加是由circRNA沉默所特有的，而線性轉(zhuǎn)錄本的敲低并沒(méi)有表現(xiàn)出這種效應(yīng)，甚至有相反的趨勢(shì)。
接下來(lái)，作者旨在研究這些circRNA在肉瘤細(xì)胞中調(diào)控干擾素和促炎信號(hào)的分子機(jī)制。circAnkib1和circCsnk1g3都具有抗炎能力，因此，作者推測(cè)circAnkib1和circCsnk1g3可以與dsRNA（模式識(shí)別受體和抗病毒免疫介質(zhì)的雙鏈RNA）結(jié)合蛋白相互作用，如PKR、MDA5和RIG - I。由于這些病毒RNA感應(yīng)機(jī)制主要是細(xì)胞質(zhì)，作者首先采用細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)分離的方法，確定circAnkib1和circCsnk1g3也優(yōu)先定位于細(xì)胞質(zhì)（圖2f）。RNA靶向熒光原位雜交（一種用來(lái)區(qū)分圓形和線性RNA異構(gòu)體的特別技術(shù)，circFISH）確認(rèn)細(xì)胞質(zhì)定位（圖2g-h）。通過(guò)RNase - R處理線性RNA降解來(lái)驗(yàn)證circFISH信號(hào)的環(huán)狀和線性特異性（圖2i）。
圖2 circRNAs在腫瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié)干擾素信號(hào)和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)
3、circRNA通過(guò)RIG-I調(diào)控干擾素基因的表達(dá)
除PKR外，其他幾種蛋白（MDA5、RIG - I）具有與病毒RNA結(jié)合并觸發(fā)干擾素和炎癥反應(yīng)的能力。因此，作者研究MDA5和RIG - I是否也能感應(yīng)內(nèi)源性circRNA。首先，作者通過(guò)檢測(cè)MDA5和RIG - I沉默后的干擾素信號(hào)來(lái)評(píng)估這些蛋白在肉瘤細(xì)胞中的活化狀態(tài)。Ddx58（編碼RIG - I）的敲低顯著降低腫瘤細(xì)胞中干擾素信號(hào)和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)（圖3a）。相反，Ifih1（編碼MDA5）的沉默僅輕微改變這些元件的表達(dá)（圖3b）。因此，作者進(jìn)一步研究circRNAs抑制炎癥信號(hào)的能力是否依賴于RIG - I。作者構(gòu)建RIG - I shRNA沉默（RIG-I KD）的肉瘤細(xì)胞，與RIG - I野生型（RIG - I WT）細(xì)胞相比，作者檢測(cè)circRNAs在RIGI KD細(xì)胞中調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)的能力。當(dāng)分別沉默circCsnk1g3或circAnkib1后，RIG-I WT細(xì)胞中干擾素相關(guān)基因和促炎因子均增加，與預(yù)期一致（圖3c）。然而，這種增加在RIG - I KD條件下被顯著抑制（圖3c）。
由于RIG - I可以直接結(jié)合病毒RNA，作者接下來(lái)試圖確定circRNA是否也可以與RIG - I發(fā)生物理相互作用。采用反向下拉評(píng)估RIG-I和circRNA的相互作用
RIG - I免疫沉淀后，對(duì)下拉材料進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)circCsnk1g3和circAnkib1富集（圖3d）。RIG - I與circRNAs的相互作用也由間歇拉片反向評(píng)估，采用改編形式的CRISPR - assisted RNA-protein interaction detection（CARPID）。簡(jiǎn)而言之，在肉瘤細(xì)胞中表達(dá)與生物素連接酶BASU融合的催化死亡Cas Rx蛋白( BASU-dCasRx )，同時(shí)靶向circRNA的剪接連接處的sgRNAs引導(dǎo)BASU-dCasRx在circCsnk1g3和circAnkib1附近的蛋白質(zhì)上添加生物素殘基（圖3e）。當(dāng)生物素下拉時(shí)，可以在與circCsnk1g3和circAnkib1相互作用的生物素化蛋白中可以檢測(cè)到RIG – I（圖3f）。
為進(jìn)一步驗(yàn)證RIG – I是肉瘤細(xì)胞干擾素信號(hào)和炎癥因子表達(dá)的主要啟動(dòng)子，且內(nèi)源性circRNA可能降低其激活，作者研究了在p53KOCcne1+肉瘤細(xì)胞中存在內(nèi)源性dsRNA，它們觸發(fā)炎癥活動(dòng)，以及內(nèi)源性circAnkib1和circCsnk1g3限制病毒模擬反應(yīng)的可能性（圖3g）。與這些假設(shè)一致，dsRNA在穩(wěn)態(tài)的肉瘤細(xì)胞中檢測(cè)到（用J2抗體）（圖3h），并且在abemaciclib（CDK4/6抑制劑）處理后進(jìn)一步升高（圖3i）。此外，abemaciclib處理除了增加dsRNA表達(dá)外，還增加肉瘤細(xì)胞中干擾素和促炎因子的表達(dá)（圖3j）。最后，在abemaciclib處理的肉瘤細(xì)胞中，circCsnk1g3的沉默進(jìn)一步增加這些基因的表達(dá)（圖3k），表明靶向circRNAs可以增強(qiáng)abemaciclib對(duì)肉瘤細(xì)胞病毒模擬反應(yīng)的影響，并可能對(duì)抗腫瘤免疫產(chǎn)生影響。因此，circAnkib1和circCsnk1g3通過(guò)RIG - I介導(dǎo)的途徑調(diào)節(jié)肉瘤細(xì)胞中干擾素和促炎信號(hào)的表達(dá)。
圖3circRNA通過(guò)RIG-I調(diào)控干擾素基因的表達(dá)
為驗(yàn)證circCsnk1g3和circAnkib1通過(guò)影響腫瘤微環(huán)境中的整體免疫景觀來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)的可能性，作者對(duì)circCsnk1g3表達(dá)或沉默的p53KOCcne1+細(xì)胞產(chǎn)生的肉瘤TME進(jìn)行比較分析。首先，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤與免疫細(xì)胞的比例。與對(duì)照組相比，circCsnk1g3沉默的腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞（CD4+和CD8+）的比例顯著降低（圖4a）。然后，為更好地確定這些腫瘤中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞的亞型，并表征circCsnk1g3在腫瘤細(xì)胞中敲低后的轉(zhuǎn)錄變化，作者對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq），用Chromium平臺(tái)（10X Genomics）解離并捕獲皮下肉瘤（shSCR和shCircCsnk1g3，每組n = 4只小鼠）。（圖4b）。通過(guò)硅質(zhì)控制去除死細(xì)胞和雙胞體，作者鑒定出9個(gè)跨條件檢測(cè)到的高水平簇，代表腫瘤細(xì)胞和TME的主要細(xì)胞群（圖4c）。根據(jù)之前發(fā)表的標(biāo)記對(duì)主要的免疫TME亞群進(jìn)行注釋后，作者通過(guò)單獨(dú)的亞聚類將NK和T淋巴細(xì)胞作為重點(diǎn)（圖4d）。
作者比較了每種條件下每種細(xì)胞類型的相對(duì)豐度和不同條件下每種細(xì)胞類型的表達(dá)譜的變化。區(qū)分4個(gè)CD4+ T細(xì)胞群，包括表達(dá)Foxp3、Il2ra、Ikzf2、Tnfrsf4和Ctla4的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和表達(dá)Ramp3、Rora和Odc1的CD4+輔助性T細(xì)胞（Th）。作者鑒定了兩群表達(dá)Foxp1和Lef1以及Ccr7或Tcf7的幼稚型CD4+ T細(xì)胞。同時(shí)檢測(cè)表達(dá)Gzmk、Cxcr6、Ccl5、Grap2或NK受體Klra6、Klra7、Klrk1、Klrd1的細(xì)胞毒性CD8+細(xì)胞。此外，單獨(dú)的CD8+ T細(xì)胞群表現(xiàn)出耗竭標(biāo)志物Lag3和Pdcd1。通過(guò)比較這些細(xì)胞類型在不同條件下的相對(duì)豐度，作者發(fā)現(xiàn)沉默circCsnk1g3與Treg和耗竭性CD8+ T細(xì)胞的減少趨勢(shì)相關(guān)；相反，細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)（圖4e）。檢測(cè)不同條件下的差異表達(dá)基因，作者發(fā)現(xiàn)在沉默circCsnk1g3的腫瘤中，與對(duì)照腫瘤相比，CD4+ T細(xì)胞平均表達(dá)更低水平的Treg相關(guān)基因，包括Tnfrsf9、Tnfrsf4、Ikzf2、Il2ra和Ctla4（圖4f）。更重要的是，免疫熒光染色證實(shí)，circRNA-KD腫瘤內(nèi)腫瘤實(shí)質(zhì)中CD3+ T細(xì)胞浸潤(rùn)增加，而對(duì)照腫瘤中T細(xì)胞主要聚集在腫瘤邊緣（圖4g-h）。這些觀察結(jié)果證實(shí)circRNA沉默可以增強(qiáng)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。接下來(lái)，為進(jìn)一步證實(shí)T細(xì)胞參與circRNA介導(dǎo)的功能，作者比較WT和circRNA沉默的肉瘤細(xì)胞在不攜帶T淋巴細(xì)胞的免疫缺陷裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況。在免疫正常小鼠中，circCsnk1g3和circAnkib1的沉默降低腫瘤的生長(zhǎng)（圖1），而在免疫缺陷小鼠品系中，circRNAs的沉默不影響腫瘤的生長(zhǎng)（圖4i），表明包括T細(xì)胞在內(nèi)的完整功能的免疫系統(tǒng)是這些circRNAs發(fā)揮促腫瘤作用是必要的。
這些數(shù)據(jù)表明，在肉瘤細(xì)胞中沉默circCsnk1g3顯著改變整個(gè)TME免疫景觀，從細(xì)胞群體的相對(duì)數(shù)量、它們的轉(zhuǎn)錄活性和T細(xì)胞在腫瘤邊界以外的浸潤(rùn)到更低的腫瘤允許條件，這可能有助于觀察到的腫瘤生長(zhǎng)減少。
圖4靶向腫瘤細(xì)胞中的circRNAs重塑腫瘤微環(huán)境
結(jié)論：
circCsnk1g3和circAnkib1通過(guò)限制腫瘤細(xì)胞中干擾素和促炎鏡子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肉瘤的生長(zhǎng)。這一作用阻礙腫瘤塊內(nèi)免疫細(xì)胞的招募和激活，從而促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的形成。
參考文獻(xiàn)：
Piras R, KO EY, Barrett C, De Simone M, Lin X, Broz MT, Tessaro FHG, Castillo-Martin M, Cordon-Cardo C, Goodridge HS, Di Vizio D, Batish M, Lawrenson K, Chen YG, Chan KS, Guarnerio J(2022). circCsnk1g3- and circAnkib1-regulated interferon responses in sarcoma promote tumorigenesis by shaping the immune microenvironment. Nat Commun. 2022;13(1):7243. doi: 10.1038/s41467-022-34872-8.