外泌體circTUBGCP4通過激活Akt信號通路促進血管內皮細胞生成和結直腸癌轉移
結直腸癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。轉移是結直腸癌患者高死亡率的主要原因。新生血管形成和血管生成是生理系統(tǒng)中轉運營養(yǎng)物質的穩(wěn)態(tài)過程。然而，穩(wěn)態(tài)在腫瘤組織中被破壞。瘤內血管過度生長形成紊亂和不穩(wěn)定的血管網(wǎng)，加速了腫瘤的生長、侵襲和轉移。近年來，越來越多的研究報道外泌體可以作為細胞間通訊的良好媒介，改變腫瘤微環(huán)境，導致腫瘤轉移。此外，來自癌細胞或其他細胞外泌體中的非編碼RNA在血管生成和腫瘤轉移中發(fā)揮重要作用。據(jù)報道，circRNA在外泌體中富集且穩(wěn)定，可能是一種有前景的癌癥診斷生物標志物。然而，外泌體circRNA在腫瘤血管生成和轉移中的作用尚不清楚。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：12.658。
研究路線：
主要研究結果：
1. CRC-CDEs促進HUVECs的遷移、管腔形成和絲狀偽足形成
為了研究CRC-CDEs在血管生成中的作用，作者首先進行了外泌體的分離和鑒定。差速離心法分離HCT116細胞和SW480細胞上清液來源的外泌體（圖1a）。?蛋白質印跡法檢測未裂解的HCT116-Exo和SW480-Exo中外泌體生物標志物（CD9、CD63、TSG-101）（圖1b）。透射電鏡結果顯示，HCT116和SW480的囊泡呈球狀，呈典型的杯狀。此外，HCT116-Exo比SW480-Exo大（圖1c）。NTA結果顯示HCT116-Exo的平均大小也高于SW480-Exo（圖1d）。然后，將1×107個HCT116細胞PKH67標記的外泌體加入HUVECs（圖1e）。共聚焦成像顯示HCT116-Exo和SW480-Exo在細胞質中聚集，提示外泌體在3h時被HUVECs攝?。▓D1f）。為確保HCT116-Exo和SW480-Exo的作用，分別用10μg和30μg外泌體孵育HUVECs。48h后，transwell實驗顯示，與PBS處理相比，不同濃度的HCT116-Exo和SW480-Exo處理顯著增強HUVECs的遷移和管腔形成（圖1g-i）。在SW480-Exo處理組中顯示了類似的趨勢（圖1h-i）。為了確定外泌體對HUVECs遷移的影響是否是由于HUVECs形態(tài)的改變，作者使用鬼筆環(huán)肽標記HUVECs中的F-肌動蛋白。有趣的是，共聚焦成像顯示HUVECs吸收HCT116-Exo和SW480-Exo后出現(xiàn)絲狀偽足（黃色點標記）（圖1j）。這些結果表明，CRC細胞來源的外泌體增強HUVECs的遷移和管形成能力，提示CRC-CDEs可以重塑受體細胞。
圖1CRC-CDEs促進HUVECs的遷移、管腔形成和絲狀偽足形成
2. CRC-CDEs促進HUVECs尖端細胞的形成
基于CRC-CDEs改變HUVECs形態(tài)的結果，作者推測CRC-CDEs可能誘導芽孢形成和尖端細胞分化。據(jù)報道，整合素β1和VEGFA參與血管的生長和成熟，對有效的內皮芽形成是必需的。作者發(fā)現(xiàn)，與PBS處理相比，高HCT116-Exo和SW480-Exo處理導致高整合素β1和VEGFA表達（圖2a）。CD34是一種公認的尖端細胞標記物，顯示出絲狀偽足延伸以促進血管生成芽。因此，作者通過免疫熒光和蛋白質印跡法檢測CRC-CDEs處理后CD34的表達。蛋白質印跡結果顯示，與PBS處理相比，HCT116-Exo和SW480-Exo處理后CD34高表達（圖2a）。免疫熒光圖像顯示，HCT116-Exo組和SW480-Exo組的CD34強度高于PBS組（圖2b）。為了確保CD34在CRC樣本中的表達，作者使用GEO數(shù)據(jù)集進行分析。結果顯示，與正常組織相比，CD34在CRC組織中顯著高表達（圖2c）。此外，作者發(fā)現(xiàn)CD34在GSE39582中的表達在N1、N2和N3組中逐漸升高。與M0組相比，M1組的CD34表達也較高，并且顯示出較差的總生存期和無復發(fā)生存期（圖2d和e）。這些數(shù)據(jù)表明，CRC-CDEs通過上調VEGFA，整合素β1和CD34的表達促進尖端細胞形成，并預測CRC轉移和CRC患者的不良預后。
圖2CRC-CDEs促進HUVECs尖端細胞的形成
3. circTUBGCP4的上調與結直腸癌的血管生成和轉移相關
為了研究CRC-CDEs來源的circRNA在促進血管生成驅動腫瘤轉移中的作用，作者比較了轉移和非轉移CRC患者血清外泌體中circRNA的表達水平。與非轉移組相比，轉移組血清外泌體中有70個circRNA表達上調，59個circRNA表達下調（圖3c）。利用人血外泌體中circRNA、lncRNA和mRNA數(shù)據(jù)庫exoRBase篩選的circRNA。然后通過HCT116-Exo、exoRBase和血清-exo中表達量最高的前20個circRNA的3個數(shù)據(jù)集選擇外顯子hsa_circRNA_101501和has_circRNA_104109（圖3d）。與HUVECs相比，HCT116和SW480中circ101501表達量的變化倍數(shù)高于circ104109（圖3e）。因此，作者選擇了circ101501，并將其更名為circTUBGCP4，其父基因為TUBGCP4。
首先，作者通過sanger測序鑒定了circTUBGCP4的環(huán)狀結構，通過發(fā)散引物（divergent primer, DP）和收斂引物（convergent primer, CP）進行了驗證，并通過放線菌素D實驗進行了驗證。sanger序列結果表明，PCR產物包含使用DP的反剪接序列（圖3f）。以cDNA為PCR模板時，DP可以擴增產物，而以gDNA為PCR模板時，DP不能擴增產物（圖3g）。放線菌素D實驗表明，circTUBGCP4比TUBGCP4更穩(wěn)定（圖3h）。這些結果證明了circTUBGCP4是一個環(huán)狀結構。為了探索circTUBGCP4在CRC中的表達及其與血管生成和轉移的關系，作者使用GEO數(shù)據(jù)集和臨床隊列（n=20對）進行分析。GSE126094數(shù)據(jù)顯示，與鄰近正常組織（AN）相比，circTUBGCP4在原發(fā)腫瘤中顯著上調（圖3i）。在GSE147597中，與非肝轉移相比，circTUBGCP4在肝轉移中被發(fā)現(xiàn)高表達（圖3j）。此外，臨床隊列的ISH結果顯示，有淋巴結轉移的原發(fā)腫瘤中的circTUBGCP4高于鄰近正常組織（圖3k）。此外，作者發(fā)現(xiàn)與低circTUBGCP4組相比，高circTUBGCP4組中CD31和CD34的表達較高（圖3l）。circTUBGCP4高表達可能與腫瘤血管生成和轉移有關。
圖3CRC-CDEs中的CircTUBGCP4與CRC的血管生成和轉移相關
4. 沉默外泌體circTUBGCP4可抑制尖端細胞形成、血管生成和腫瘤轉移
為了探究外泌體circTUBGCP4在HUVECs中的生物學功能，作者首先要確保外泌體circTUBGCP4能夠被HUVECs吸收。作者分離出HCT116-Exo和SW480-Exo來孵育HUVECs 6h和12h。作者發(fā)現(xiàn)，與沒有外泌體處理的組相比，circTUBGCP4在HCT116-Exo-6h組和SW480-Exo-6h組中上調（圖4a）。這些結果驗證了腫瘤細胞來源的circTUBGCP4可能通過組裝成外泌體進入HUVECs。在HCT116和SW480中構建circTUBGCP4敲低的穩(wěn)定細胞株。結果顯示，與shNC組相比，circTUBGCP4-01和shcircTUBGCP4-02組中circTUBGCP4顯著下調，而其親本基因無變化（圖4b）。然后，作者從穩(wěn)定細胞系中提取外泌體，研究其對HUVECs的生物學效應。管形成實驗表明，敲低exo-circTUBGCP4顯著降低了HUVECs中的節(jié)點數(shù)量（圖4c）。Transwell實驗顯示，下調exo-circTUBGCP4可降低細胞遷移能力（圖4d）。細胞劃痕實驗顯示，與shNC組相比，shcircTUBGCP4-01和shTUBGCP4-02組的愈合速度較慢（圖4e-f）。蛋白質印跡結果顯示，在shcircTUBGCP4-Exo處理的HUVECs中，CD34、整合素β1和VEGFA的表達下調（圖4f）。此外，免疫熒光結果顯示，來自HCT116和SW480的Exo-ShCirc-01和ShCirc-01組中CD34低表達（圖4g）。為了評估外泌體circTUBGCP4對體內血管生成和腫瘤轉移的潛在貢獻，作者首先注射HCT116細胞，兩周后通過尾靜脈注射來自Sh-NC和Sh-Circ-02組的外泌體（圖5a）。結果表明，與PBS和HCT116Exo-Sh-Circ-02相比，HCT116Exo-Sh-NC導致肺結節(jié)增加（圖5b-c）。此外，HCT116Exo-Sh-NC組肺結節(jié)內血管數(shù)量增加，HCT116Exo-Sh-Circ-02組肺結節(jié)內血管數(shù)量減少（圖5d-e）。這些結果證明外泌體circTUBGCP4可誘導尖端細胞形成、血管生成和腫瘤轉移。
圖4外泌體circTUBGCP4促進HUVECs尖端細胞形成、遷移和管腔形成
圖5過表達circTUBGCP4促進血管生成和腫瘤轉移
5. 過表達circTUBGCP4促進尖端細胞形成、血管生成和腫瘤轉移
為了在體外和體內評估circTUBGCP4效應的潛在貢獻，作者首先構建了circTUBGCP4的過表達質粒和慢病毒。接下來，作者驗證了穩(wěn)定細胞株的過表達效率，并構建了尾靜脈模型（圖5f、g）。體內熒光成像結果顯示，30d后LV-CircTUBGCP4組小鼠肺內熒光強于LV-NC組（圖5h）。LV-CircTUBGCP4組肺轉移結節(jié)數(shù)量多于LV-NC組（圖5i）。此外，HE結果和IHC結果顯示LV-CircTUBGCP4組比LV-NC組有更多的血管和微血管（圖5j-l）。有趣的是，與LV-NC組相比，LV-CircTUBGCP4組的肺轉移結節(jié)中CD31+和CD34+均較高（圖5k-1）。這些結果表明，過表達的circRNA可通過增強血管生成促進腫瘤轉移。
6. HUVECs中CircTUBGCP4通過靶向miR-146b-3p/PDK2軸激活Akt信號通路
為了探索外泌體circTUBGCP4的潛在調控，作者考慮了circTUBGCP4是否作為海綿吸附miRNAs。首先，作者使用了癌癥特異性circRNAs數(shù)據(jù)庫在circTUBGCP4中發(fā)現(xiàn)了8個AGO2結合位點。此外，AGO2-RIP驗證了circTBUGCP4可以結合AGO2蛋白，這提示了circTUBGCP4結合miRNA的潛力（圖6a）。然后，作者從作者的環(huán)狀RNA陣列分析和CIRCinteractiome的交集中選擇了miR-146b-3p和miR-873-5p（圖6b）。作者設計了靶向反向剪接連接的circTUBGCP4生物素探針，并在轉染過表達circTUBGCP4的HUVECs中驗證了良好的下拉效率（圖6c）。circRNA pull-down結果顯示，在HUVEC裂解緩沖液中，circTUBGCP4探針可以顯著結合miR-146b-3p，而不是miR-873-5p（圖6d）。此外，當HUVECs過表達circTUBGCP4時，circTUBGCP4探針可以拉出更多的miR-146b-3p（圖6e）。接下來，作者發(fā)現(xiàn)circTUBGCP4有兩個位點來海綿化miR-146b-3p（圖6f）?；趦蓚€結合位點，作者構建了circTUBGCP4的全突變質粒。結果表明，circTUBGCP4可以基于293 T中的兩個位點與miR-146b-3p結合（圖6g）。
有研究報道癌細胞與HUVECs共培養(yǎng)可以通過激活PI3K/Akt信號通路增加內皮細胞的管腔形成和存活。因此，作者想知道外泌體circTUBGCP4是否通過激活Akt通路促進內皮細胞管的形成。Western blot結果顯示，HCT116-Exo和SW480-Exo處理的HUVECs中p-AKT表達上調，而shcircTUBGCP4-01-Exo和shcircTUBGCP4-02-Exo處理的HUVECs中p-AKT表達下調（圖6h和i）。因此，作者篩選了與PI3K/Akt信號通路相關的miR-146b-3p靶點。巧合的是，在Targetscan和miRDB數(shù)據(jù)庫中篩選出的141個靶基因中，與PI3K/Akt信號通路相關的基因是PDK2（圖6j）。此外，作者還篩選了與PI3K/Akt信號通路直接相關的其他初級基因（圖6j）。然后，與NC相比，PDK2是HUVECs過表達miR-146b-3p中唯一下調的靶點（圖6k）。此外，PDK2可以被circTUBGCP4上調，而被HCT116和SW480的Exo-Sh-Circ-01和Exo-Sh-Circ-02下調（圖6l）。為了證明miR-146b-3p靶向PDK2-3'UTR，作者設計了miR-146b-3p生物素探針來下調PDK2。結果顯示，miR-146b-3p探針可以顯著富集PDK2（圖6m）。然后，作者構建了攜帶雙熒光素酶報告基因的PDK2-3'UTR質粒，并預測了其在293 T細胞中PDK2-3'UTR的結合位點（圖6n）。結果顯示，在293 T細胞中，PDK2-3'UTR可以被miR-146b-3p結合（圖6o）。為了證實circTUBGCP4通過miR-146b-3p激活Akt信號通路，作者在過表達circTUBGCP4和過表達miR-146b-3p時對HUVECs進行轉染。結果顯示，PDK2在過表達circTUBGCP4的HUVECs中mRNA水平和蛋白水平均升高。在HUVECs中，miR-146b-3p模擬物抑制miR-146b-3p的增加（圖6p）。綜上所述，這些結果表明circTUBGCP4可以通過海綿miR-146b-3p促進PDK2來激活Akt信號。
圖6 CircTUBGCP4海綿miR-146b-3p上調PDK2激活HUVECs中Akt信號通路
7. MiR-146b-3p抑制HUVECs遷移、管腔形成和尖端細胞形成
接下來，基于上述發(fā)現(xiàn)，作者檢測HCT116-Exo和SW480-Exo處理HUVECs 6h、12h、24h后miR-146b-3p的表達。如圖7a-b所示，HCT116-Exo和SW480-Exo處理HUVECs后miR-146b-3p的表達逐漸降低。Transwell遷移實驗顯示，過表達miR-146b-3p顯著抑制HUVECs遷移（圖7c）。此外，劃痕實驗也顯示，與NC模擬物組相比，miR-146b-3p模擬物組HUVECs的傷口閉合速度較慢（圖7d）。此外，過表達miR-146b-3p顯著抑制HUVECs在4h和6h后的節(jié)點形成（圖7e）。然后，根據(jù)蛋白質印跡結果，作者發(fā)現(xiàn)miR-146b-3p可以顯著抑制CD34的表達，也可以抑制PDK2的表達和AKT的激活（圖7f）。
圖7miR-146b-3p在HUVECs中的作用，以及外泌體circTUBGCP4在miR-146b-3p調控的HUVECs功能障礙中的作用。
8. 外泌體circTUBGCP4通過抑制miR-146b-3p增強HUVECs遷移、管狀細胞形成和尖端細胞形成
為了探究miR-146b-3p對circTUBGCP4調控HUVECs功能的潛在作用，作者使用HCT116-LV-CircTUBGCP4來源的外泌體孵育HUVECs，隨后轉染miR-146b-3p模擬物。然后，transwell遷移實驗顯示，與HCT116和SW480的Exo-LVNC相比，Exo-LVcircTUBGCP4處理的HUVECs遷移能力增強，然后miR-146b mimic抑制這種增加的趨勢（圖7g）。管形成實驗的類似結果表明，與HCT116和SW480的Exo-LVNC相比，Exo-LVcircTUBGCP4處理的HUVECs具有更多的節(jié)點，然后被miR-146b模擬物抑制（圖7h）。激光共聚焦圖像顯示，Exo-LVcircTUBGCP4處理的HUVECs比Exo-LVNC處理的HUVECs有更多的絲狀偽足和更高的CD34表達。然而，miR-146b-3p抑制了這一上升趨勢（圖7i-j）。這些結果表明，外泌體circTUBGCP4通過吸附miR-146b-3p增強HUVECs的細胞遷移、管狀細胞形成和尖端細胞形成。
外泌體circTUBGCP4在血管生成和腫瘤轉移中的功能示意圖模型
結論：
該研究結果證明CRC-CDEs誘導更多的絲狀偽足和血管內皮尖細胞形成，從而促進細胞遷移和管狀形成。此外，該研究鑒定了CRC-CDEs中的circTUBGCP4，它可以被轉運到血管內皮細胞中，從而促進細胞遷移、管狀細胞形成和尖端細胞形成。機制上，該研究發(fā)現(xiàn)circTUBGCP4可以靶向miR-146b-3p觸發(fā)血管內皮細胞中的Akt信號通路。該研究闡明了一種新的腫瘤誘導血管生成機制，可能為結直腸癌的抗血管生成治療提供新的途徑。
參考文獻：
Chen C, Liu Y, Liu L, Si C, Xu Y, Wu X, et al. Exosomal circTUBGCP4 promotes vascular endothelial cell tipping and colorectal cancer metastasis by activating Akt signaling pathway. J ExpClin Cancer Res. 2023 Feb 15;42(1):46. doi: 10.1186/s13046-023-02619-y.