看過來！涉及鐵死亡和脂質(zhì)過氧化的11分文章

鐵死亡是一種鐵依賴的細(xì)胞死亡，伴隨著脂質(zhì)過氧化的積累和抗氧化系統(tǒng)的功能障礙。谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）是肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。然而，鐵死亡在ALS中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)ALS中SPY1表達(dá)降低是由MDM2（核定位的E3泛素連接酶）介導(dǎo)的泛素化降解導(dǎo)致的。此外，SPY1通過緩解GCH1 / BH4軸（鐵死亡的一個(gè)電阻軸）失調(diào)和轉(zhuǎn)鐵受體蛋白1（TFR1）誘導(dǎo)的鐵產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化。此外，神經(jīng)元特異性過表達(dá)SPY1通過上述兩條通路顯著延緩ALS轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)病并延長生存期。這些結(jié)果表明SPY1是鐵死亡和ALS的新靶點(diǎn)。本研究于2023年1月發(fā)表于《Cell DeathDiffer》，IF：11.84。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、原代大鼠神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示ALS、鐵下垂和SPY1之間的關(guān)聯(lián)

為初步篩選ASL（肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥）相關(guān)機(jī)制和靶基因，GEO數(shù)據(jù)庫中選取GSE7493進(jìn)行分析。首先，對SOD1^G93A大鼠胚胎運(yùn)動神經(jīng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，減少個(gè)體偏差的影響。接下來，使用從FerrDb下載的鐵死亡相關(guān)基因集，通過GSEA工具對所有16324個(gè)基因進(jìn)行富集。ALS轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在鐵死亡中顯著富集（圖1B）。為鑒定靶基因，進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。共篩選出417個(gè)DEGs（DEGs）。其中，SPY1被證實(shí)在小鼠和細(xì)胞中下調(diào)（圖1C）。隨后，為鑒定SPY1（Speedy/RINGO細(xì)胞周期調(diào)節(jié)器家族成員A）參與ALS的潛在效應(yīng)基因，對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，SPY1高、低表達(dá)組。篩選出215個(gè)上調(diào)基因和205個(gè)下調(diào)基因（圖1D）。通過對比MU vsWT、SPY1高vs低和鐵死亡相關(guān)的基因集，作者發(fā)現(xiàn)GTP環(huán)化水解酶GCH1是唯一與ALS、鐵死亡和SPY1連鎖的基因（圖1E）。此外，David還從生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能等方面對SPY1高、低序列中的DEGs進(jìn)行功能標(biāo)注表明GTPase活性也與SPY1表達(dá)相關(guān)（圖1F）。最后，通過Pearson相關(guān)性分析確定SPY1和GCH1之間的直接正相關(guān)性（圖1G）。這些生物信息學(xué)結(jié)果提示SPY1可能通過GCH1在ALS中發(fā)揮影響鐵死亡的作用。

圖1原代大鼠神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)揭示ALS、鐵下垂和SPY1之間的關(guān)聯(lián)

2、鐵死亡參與ALS細(xì)胞模型

為進(jìn)一步驗(yàn)證鐵死亡在ALS中存在，選擇NSC34細(xì)胞作為MNs（運(yùn)動神經(jīng)元）體外培養(yǎng)的體外細(xì)胞系，驗(yàn)證生物信息學(xué)分析結(jié)果。通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSOD1^G93A成功建立ALS模型。為初步判斷細(xì)胞死亡情況，采用CCK8發(fā)現(xiàn)2μM RSL3（抑制GPX4的鐵死亡誘導(dǎo)劑）孵育NSC34細(xì)胞2 h后，DFO和Fer-1（經(jīng)典的鐵死亡抑制劑）可特異性調(diào)控NSC34細(xì)胞中的鐵死亡，而Zvad（caspase凋亡抑制劑）和Nec-1（RIPK1的壞死性凋亡抑制劑）對NSC34細(xì)胞中的鐵死亡無調(diào)控作用（圖2A）。Zvad和Nec-1對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，而鐵死亡抑制劑Fer-1沒有作用（圖2B）。然而，凋亡和鐵死亡的抑制劑均能增強(qiáng)hSOD1^G93A細(xì)胞的活力（圖2C）。此外，這兩種抑制劑的組合顯示出明顯高于任何其他組合或任何單獨(dú)試劑的活性（圖2C）。這些結(jié)果表明細(xì)胞凋亡和鐵死亡對ALS都有貢獻(xiàn)。

為進(jìn)行系統(tǒng)的研究，對鐵死亡參與的鐵積累、脂質(zhì)過氧化和GSH（谷胱甘肽）消耗等典型特征進(jìn)行測試。首先，通過C11-BODIPY熒光探針檢測到hSOD1^G93A與WT相比發(fā)生明顯的脂質(zhì)過氧化，并且可以被鐵死亡抑制劑所限制（圖2D-E）。電鏡照片顯示，hSOD1^G93A引起的線粒體減少、膜密度增加和嵴破壞與鐵死亡誘導(dǎo)的相同（圖2F）。此外，Calcein AM試驗(yàn)證實(shí)LIP升高（圖2G）。用試劑盒檢測，與對照組相比，hSOD1^G93A也出現(xiàn)GSH的異常降低（圖2H）。qRT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡雜交驗(yàn)證篩選的鐵死亡DEGs和關(guān)鍵基因的表達(dá)情況。突變體導(dǎo)致ALOX15和GDF15（分別是鐵死亡的一個(gè)驅(qū)動和一個(gè)標(biāo)記）上調(diào)，GCH1和GPX4下調(diào)，F(xiàn)SP1未發(fā)生變化（圖1C, 2I-K）。這些結(jié)果系統(tǒng)地證明鐵死亡參與ALS及相關(guān)特征。

圖2鐵死亡參與ALS的細(xì)胞模型

3、MDM2在ALS中通過泛素化降解SPY1

為探究ALS中SPY1減少的原因，qRT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡雜交檢測轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，發(fā)現(xiàn)mRNA比例下降不如蛋白明顯（圖3A-C）。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，使用MG132（蛋白酶體抑制劑）而不是胃酶抑素A與E64D（PE，自噬-溶酶體抑制劑）共孵育可以上調(diào)SPY1的表達(dá)（圖3D-E）。與預(yù)期一致，SPY1的泛素化水平在hSOD1^G93A中顯著升高（圖3F）。然而，免疫共沉淀（CoIP）檢測到SPY1與SKP2或NEDD4的相互作用沒有明顯增加（圖3G）。為尋找ALS中介導(dǎo)SPY1泛素化的真正蛋白，利用氨基酸序列通過UbiBrowser預(yù)測具有相應(yīng)組合結(jié)構(gòu)的E3連接酶，其中MDM2（核定位的E3泛素連接酶）獲得最高的預(yù)測評分（圖3H）。值得注意的是，轉(zhuǎn)染MDM2后，SPY1及其泛素化水平均呈劑量依賴性增加，敲低實(shí)驗(yàn)中SPY1的降解受到抑制（圖3I-K）。更令人興奮的是，CoIP證實(shí)hSOD1^G93A中SPY1與MDM2的外源性和內(nèi)源性相互作用比野生型增強(qiáng)（圖3L）。此外，在NEDD4和SKP2不變的情況下，hSOD1^G93A中MDM2的表達(dá)顯著增加（圖3M-N）。這些結(jié)果闡明升高的MDM2介導(dǎo)SPY1的泛素化，而SPY1的泛素化主要導(dǎo)致ALS表達(dá)降低。

圖3ALS中SPY1的減少是由MDM2介導(dǎo)的

4、ALS中SPY1過表達(dá)抑制鐵死亡

為確定SPY1與鐵死亡之間的關(guān)系，在hSOD1^G93A和NSC34細(xì)胞中分別構(gòu)建了SPY1的過表達(dá)和敲低（圖4A）。在NSC34細(xì)胞中驗(yàn)證過表達(dá)SPY1增強(qiáng)對RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡的抗性，同時(shí)也減少hSOD1^G93A細(xì)胞的死亡（圖4B-C）。在hSOD1^G93A細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SPY1后，脂質(zhì)過氧化和游離鐵呈劑量依賴性減少（圖4D-F）。盡管GSH增加，但與轉(zhuǎn)染劑量無關(guān)（圖4G）。過表達(dá)SPY1對線粒體功能的保護(hù)是通過降低線粒體脂質(zhì)過氧化的熒光和緩解線粒體膜電位（MMP）的下降來實(shí)現(xiàn)的（圖4H-I）。這些結(jié)果表明SPY1是ALS中鐵死亡的有效抑制劑。此外，其對RSL3誘導(dǎo)和Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡的抵抗也發(fā)生在其他腫瘤細(xì)胞中（圖4J-L）。上述結(jié)果表明ALS中SPY1過表達(dá)抑制鐵死亡。

圖4過表達(dá)的SPY1在ALS細(xì)胞模型中抵抗鐵下垂

5、SPY1通過調(diào)控GCH1/BH4和TFR1抵制鐵死亡

為進(jìn)一步探究SPY1調(diào)控鐵死亡的機(jī)制，首先在過表達(dá)SPY1和對照的細(xì)胞中篩選ALS中發(fā)生改變的關(guān)鍵基因的mRNA。在SPY1高vs低，上調(diào)的鐵死亡抑制因子GCH1被推測負(fù)責(zé)抵抗鐵死亡（圖1D-G）。隨后，通過過表達(dá)SPY1轉(zhuǎn)染（圖5A-B），證實(shí)GCH1的翻譯水平呈劑量依賴性上調(diào)。GCH1是BH4合成的限速酶，過表達(dá)SPY1后BH4合成顯著增加，敲低GCH1后BH4合成減少（圖5C）。同樣，敲低GCH1后，過表達(dá)SPY1引起的細(xì)胞活力和脂質(zhì)氧化的變化被逆轉(zhuǎn)（圖5D-F）。然而，LIP與GCH1的表達(dá)無關(guān)（圖5G）。雖然給予BH4和過表達(dá)GCH1保護(hù)了SPY1敲低細(xì)胞的大部分活力和脂質(zhì)過氧化（圖5H-I）。已知游離鐵在產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化中起著重要的作用，DFO和BH4的結(jié)合是偶然的，并意外地顯示出額外的改進(jìn)（圖5H-I）。

為尋求不依賴于GCH1 / BH4軸對活性鐵的調(diào)控，在過表達(dá)SPY1的細(xì)胞中檢測鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。與對照相比，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)鐵進(jìn)入細(xì)胞的TFR1（轉(zhuǎn)鐵受體蛋白1）的mRNA增加，DMT1和FPN1不變，分別負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)鐵的釋放和輸出（圖5J）。與mRNA一致，蛋白水平顯示過表達(dá)SPY1降低hSOD1^G93A中異常升高的TFR1（圖5K）。

為確定SPY1對鐵死亡的抵抗是否通過調(diào)節(jié)P53介導(dǎo)，作者檢測在SPY1-Flag細(xì)胞中過表達(dá)P53對細(xì)胞活力和相關(guān)蛋白的影響。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)P53引起的反向細(xì)胞死亡可以被凋亡抑制劑和鐵死亡抑制劑挽救，尤其是DFO，暗示P53與游離鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)存在聯(lián)系（圖5L）。并且隨著p53的過表達(dá)，TFR1而不是GCH1的表達(dá)上調(diào)（圖5M）。在表達(dá)SP1（S59A）突變后，作者發(fā)現(xiàn)SPY1可以通過上調(diào)SPY1的磷酸化水平激活GCH1（圖5N）。綜上所述，SPY1對鐵下垂的抑制主要是通過調(diào)節(jié)GCH1/BH4軸抑制脂質(zhì)過氧化TFR1表達(dá)式。

圖5SPY1通過調(diào)控GCH1/BH4和TFR1抑制鐵死亡

6、SPY1通過抑制神經(jīng)元鐵下垂保護(hù)ALS小鼠模型

為證明SPY1過表達(dá)對體內(nèi)ALS進(jìn)展的影響，將神經(jīng)元特異性表達(dá)的重組病毒注射到hSOD1^G93A小鼠的側(cè)腦室（圖6A）。進(jìn)行性肌無力和肌萎縮是ALS的主要表現(xiàn)。為評估肌肉狀態(tài)，在病程中監(jiān)測轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)和體重。SPY1過表達(dá)的hSOD1^G93A小鼠運(yùn)動能力的下降被延緩（圖6B）。體重下降的發(fā)生也延遲了約2周（圖6C）。肌無力程度和肌肉萎縮程度是影響ALS發(fā)病和生存的主導(dǎo)因素。與對照相比，過表達(dá)SPY1延緩了（128.90 ± 8.17 vs.120.40 ± 7.28 d）的發(fā)生，延長了（149.90 ± 12.72 vs.136.80 ± 7.98 d）的存活（圖6D-E）。

接下來，對150 d的小鼠腓腸肌和腰髓組織進(jìn)行組織化學(xué)染色，以闡明SPY1的保護(hù)機(jī)制。結(jié)果顯示，SPY1顯著延緩轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)對應(yīng)的hSOD1^G93A小鼠神經(jīng)源性萎縮（圖6F）。作為MNs的特異性標(biāo)志物，脊髓前角SMI32染色發(fā)現(xiàn)SPY1減少了MNs的丟失（圖6F-G）。TFR1自身表達(dá)量的增加是鐵積累的有力證據(jù)，在hSOD1^G93A中發(fā)現(xiàn)并被SPY1校正（圖6F-H）。此外，脂質(zhì)氧化標(biāo)志物4-HNE的免疫組化結(jié)果顯示，過表達(dá)SPY1的小鼠，其最初升高的脂質(zhì)過氧化水平降低（圖6F-I）。此外，SPY1維持了較為健康的線粒體形態(tài)（圖6J）。通過免疫組化驗(yàn)證TFR1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GCH1在hSOD1^G93A小鼠中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)SPY1后GCH1被激活（圖6K-L）。這些在hSOD1^G93A小鼠中得到的結(jié)果與體外一致，強(qiáng)調(diào)SPY1通過抑制ALS中神經(jīng)元鐵死亡來延長存活。

圖6SPY1在hSOD1^G93A小鼠中通過抵抗神經(jīng)元鐵死亡發(fā)揮保護(hù)作用。

結(jié)論：

作者通過對ALS中基因SPY1的功能富集，發(fā)現(xiàn)其具有轉(zhuǎn)錄正調(diào)控作用，也為SPY1通過磷酸化SP1調(diào)控GCH1的表達(dá)奠定基礎(chǔ)。此外，抑制或敲低USP7增強(qiáng)p53的泛素化，伴隨著p53水平的降低，導(dǎo)致TFR1的下調(diào)。作者的結(jié)果也表明SPY1通過抑制P53來調(diào)控TFR1。

參考文獻(xiàn)：

Wang Y, Wang C. (2023). Quantitative reactive cysteinome profiling reveals a functional link between ferroptosis and proteasome-mediated degradation. Cell DeathDiffer. 30（1）:125-136. doi: 10.1038/s41418-022-01050-8.