食管鱗狀細胞癌(ESCC)是全球最常見的食管癌,在癌癥中發(fā)病率排名第七,死亡率排名第六。全球超過一半的ESCC病例發(fā)生在中國。盡管ESCC的治療策略取得較大進展,但其癥狀發(fā)作較晚且具有腫瘤異質性,這意味著大多數(shù)患者的預后較差。因此,了解疾病如何進展并確定可靠的預后標志物可能會改善ESCC的治療和監(jiān)測,從而改善預后。該研究發(fā)表在《Cell Death Discovery》,IF:7.109。
技術路線:
主要研究結果:
1. circTRPS1-2在ESCC組織中的表達
對三對匹配的ESCC和相鄰正常組織進行高通量測序,確定了2685個在癌癥中上調的circRNA和4881個下調的circRNA(圖1a, b)。用fold change≥2和P<0.05的臨界標準,確定了5個上調的circRNA子集(hsa_circ_0006156、hsa_circ_0003764、hsa_circ_0000198、hsa_circ_0007324和hsa_circ_0016600)和41個下調circRNA的子集(圖1c)。使用一組獨立的30對ESCC和相鄰正常組織,作者驗證了5個上調的circRNA和以下10個下調最多的circRNA(圖1d):hsa_circ_0026782, hsa_circ_0085362(circTRPS1-2), hsa_circ_0078299, hsa_circ_0000099, hsa_circ_0008967, hsa_circ_0001546, hsa_circ_0001882, hsa_circ_0001073, hsa_circ_0000638和hsa_circ_0000117。用引物檢測的特異性較弱的circRNA被排除。最后,作者決定關注最失調的circRNA, circTRPS1-2,進行進一步研究。
圖1通過ESCC組織高通量測序鑒定circTRPS1-2
2. circTRPS1-2在ESCC中的表達下調及亞細胞定位
根據(jù)UCSC基因組瀏覽器(GRCh37/hg19),CircTRPS1-2位于染色體8:116599227-116635985(圖2a)。該基因由TRPS1基因的第2外顯子到第5外顯子反向剪接產(chǎn)生,長度為2821 bp(圖2b)。作者發(fā)現(xiàn),與HEECs相比,circTRPS1-2在K150和E109細胞系中均下調(圖2c)。反向剪接通過qRT-PCR產(chǎn)物的Sanger測序進行驗證(圖2d)。發(fā)散引物可從cDNA而非基因組DNA擴增circTRPS1-2,而聚合引物可從cDNA和基因組DNA擴增線性TRPS1(圖2e)。這些結果支持以下觀點:circTRPS1-2是通過反向剪接而不是反式剪接或基因組重排產(chǎn)生。CircTRPS1-2的環(huán)狀結構通過其對RNAse R消化的抗性得到了證實(圖2f)。根據(jù)FISH(圖2g)和核質分選(圖2h),CircTRPS1-2主要定位于細胞質和細胞核。
圖2circTRPS1-2在食管鱗狀細胞癌組織中的表征和亞細胞定位
3. circTRPS1-2在ESCC中表達下調并與不良預后相關
在一組30例匹配的ESCC和相鄰正常組織中,作者發(fā)現(xiàn)circTRPS1-2在腫瘤中顯著下調(圖3a)。在BaseScope檢測中獲得了類似的結果,環(huán)狀RNA主要定位于細胞質和細胞核(圖3b, c)。在30例患者中,circTRPS1-2表達低于中位水平的患者3年總生存率顯著低于表達高于中位水平的患者(圖3d)。circTRPS1-2可能作為腫瘤抑制因子對抗ESCC,其低表達預示不良預后。
圖3circTRPS1-2在ESCC中表達下調,其表達與患者預后呈正相關
4. CircTRPS1-2抑制ESCC細胞的增殖和遷移
為了研究circTRPS1-2在ESCC細胞中的生物學功能,作者在兩種ESCC細胞系中分別轉染過表達circTRPS1-2的質粒和敲低circTRPS1-2的siRNA(圖4a)。這些轉染沒有顯著影響線性TRPS1的表達(圖4b)?;诳寺⌒纬蓪嶒灒▓D4c, d),EdU摻入實驗(圖4e, f)和CCK-8實驗(圖4g),過表達circTRPS1-2顯著降低了ESCC細胞的活力和增殖能力。基于傷口愈合(圖4h, i)和transwell遷移(圖4j, k)的實驗,它還顯著降低了ESCC細胞的遷移能力。敲低circTRPS1-2具有相反的作用。
圖4circTRPS1-2抑制ESCC細胞增殖和遷移
5. CircTRPS1-2抑制體內(nèi)腫瘤的發(fā)生和轉移
作者通過皮下或尾靜脈給小鼠注射了已感染過表達circTRPS1-2或shRNA的重組慢病毒的K150細胞,以敲低circTRPS1-2。在皮下腫瘤實驗中(圖5a),過表達circTRPS1-2導致腫瘤體積(圖5b)和重量(圖5c)顯著減小。而敲低circTRPS1-2則產(chǎn)生相反的作用。在腫瘤轉移實驗中,敲低circTRPS1-2顯示出顯著更多的淺表轉移(圖5d)、肺轉移(圖5e, f)和表面和深部的總體轉移(圖5g)。過表達circTRPS1-2顯示更少的肺轉移(圖5f)和總轉移(圖5g)。
圖5CircTRPS1-2在體內(nèi)抑制ESCC的發(fā)生和轉移
6. CircTRPS1-2可能調控核糖體的生物發(fā)生
為了闡明circTRPS1-2在ESCC中發(fā)揮腫瘤抑制作用的通路,作者在K150細胞中免疫沉淀RNA,并使用質譜鑒定了潛在的蛋白結合伴侶。在排除了由正義和反義RNA探針拉下的26個蛋白質后,作者分析了與正義探針特異性結合的15個蛋白質(圖6a)。與之前的研究不同,作者在RNA pulldown實驗中沒有檢測到Argonaute2,這表明microRNA海綿可能不是circTRPS1-2的主要功能機制。GO和KEGG富集分析表明,這15種蛋白與核糖體和核糖體RNA在核糖體和細胞質中的加工密切相關(圖6b, c)。作者假設circTRPS1-2可能參與核糖體的生物發(fā)生,因此作者在15個候選相互作用子中檢測了5種核糖體蛋白:S4X、S8、S24、L7和L11。作者使用RNA pulldown證實circTRPS1-2直接與這些蛋白質結合,隨后使用蛋白質印跡法(圖6d);使用RNA免疫沉淀,隨后進行qRT-PCR(圖6e);以及使用免疫熒光染色(圖6f),將所有5種核糖體蛋白定位到細胞質和細胞核,類似于circTRPS1-2。接下來,作者用過表達或敲低circTRPS1-2的重組慢病毒感染K150細胞。根據(jù)260nm處的吸光度(圖6g),過表達導致細胞提取物中核糖體水平較低,且降低到較高水平(圖6g)。電鏡觀察顯示,過表達導致核糖體數(shù)量和核仁減少,而敲低則相反(圖6h)。
圖6circTRPS1-2與核糖體蛋白的結合及其對核糖體生物發(fā)生的影響
結論:
該研究發(fā)現(xiàn)了一個新的circRNA,circTRPS1-2,可以通過減少核糖體的產(chǎn)生來抑制ESCC的增殖和遷移,并確立了它在ESCC治療和預后預測中的潛在用途。
參考文獻:
Zhao R, Chen P, Qu C, Liang J, Cheng Y, Sun Z, Tian H. Circular RNA circTRPS1-2 inhibits the proliferation and migration of esophageal squamous cell carcinoma by reducing the production of ribosomes. Cell Death Discov. 2023 Jan 12;9(1):5. doi: 10.1038/s41420-023-01300-9.