MicroRNA-210在心肌梗死中控制線粒體代謝并保護(hù)心臟功能

盡管最近在急性心肌梗塞（AMI）的治療和患者生存率的改善方面取得了進(jìn)展，但缺血性心臟病仍然是全球死亡的主要原因，也是慢性心力衰竭的主要原因。仍然需要新的心臟保護(hù)策略來(lái)減輕AMI的有害影響，并改善冠心病患者的不良心臟重塑和心功能障礙。動(dòng)物研究表明，microRNA 210（miR-210）是治療缺血性心臟病的潛在療法，以改善心肌梗死小鼠模型中的心臟功能。人體臨床研究表明miR-210是冠狀動(dòng)脈疾病的生物標(biāo)志物。MiR-210是細(xì)胞缺氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，通過(guò)靶向線粒體能量代謝和活性氧（ROS）通量。線粒體除了通過(guò)氧化磷酸化是收縮細(xì)胞ATP的主要來(lái)源外，還是細(xì)胞ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵來(lái)源。在缺血再灌注（IR）的情況下重新編程線粒體代謝和ROS通量是心臟損傷的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。因此，在IR期間抑制線粒體呼吸鏈和減少線粒體耗氧量可保護(hù)缺血性心臟病。該研究發(fā)表于《Circulation》，IF: 39.918。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. MiR-210缺乏以性別依賴的方式加重IR誘導(dǎo)的雄性小鼠心功能障礙

MiR-210敲除小鼠和其野生型對(duì)照C57Bl/6小鼠在2月齡時(shí)通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左中前降支30分鐘后再灌注的方法建立在體心臟缺血再灌注模型。未結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的假手術(shù)動(dòng)物作為對(duì)照組。分別于再灌注4 h和24 h后分離心臟，檢測(cè)心臟中miR-210的表達(dá)。如圖1A所示，在WT小鼠的心臟中，miR-210在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都顯著增加，而KO小鼠沒有。在女性和男性基線之間以及在女性和男性IR治療之間沒有發(fā)現(xiàn)miR-210水平的顯著差異。在體內(nèi)IR治療前和治療后6周，通過(guò)超聲心動(dòng)圖評(píng)估心功能。如圖1B至1E和圖S1A至S1G所示，在基線和假手術(shù)動(dòng)物中，miR-210 KO和WT小鼠的超聲心動(dòng)圖無(wú)顯著差異。IR導(dǎo)致雄性WT小鼠室間隔舒張末期、收縮末期、舒張末期左心室后壁厚度、收縮末期左心室后壁厚度、射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)降低，左心室舒張末期內(nèi)徑、收縮末期內(nèi)徑、舒張末期容積、收縮末期容積增加。在雌性WT小鼠中，IR降低EF和FS，增加左室收縮末期內(nèi)徑和收縮末期容積。值得關(guān)注的是，miR-210的缺失揭示了顯著的性別差異，并顯著加重了IR誘導(dǎo)的雄性小鼠心臟功能障礙，而不影響雌性動(dòng)物。

圖1MiR-210缺陷加重雄性小鼠心肌梗死后的心功能障礙

2. MiR-210模擬物挽救了MiR-210缺乏對(duì)ir誘導(dǎo)的心肌梗死和心功能障礙的作用

鑒于miR-210缺陷僅影響雄性小鼠，作者接下來(lái)的研究將集中在雄性動(dòng)物。作者發(fā)現(xiàn)，與野生型對(duì)照相比，在急性IR損傷的情況下，miR-210缺乏增加了MI體積，而miR-210模擬物挽救了miR-210缺乏對(duì)MI的影響(圖2A和2B)。同樣，miR-210缺陷增強(qiáng)了LV EF和FS的功能障礙，而miR-210模擬物阻斷了miR-210 KO小鼠中過(guò)度的功能障礙(圖2C和圖2D)。

圖2MiR-210 mimic對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌梗死和心功能障礙具有保護(hù)作用

3. MiR-210在急性心臟IR中控制線粒體生物能學(xué)

線粒體是miR-210在細(xì)胞缺氧反應(yīng)中的主要靶點(diǎn)。在缺血再灌注過(guò)程中抑制線粒體耗氧量和生物能對(duì)缺血性心臟病具有保護(hù)作用。因此，作者研究了miR-210在急性心臟IR中控制線粒體生物能學(xué)的作用。與此同時(shí)，作者進(jìn)行了Seahorse通量分析，以評(píng)估離體心肌纖維束的氧消耗率(OCR，氧化磷酸化指數(shù))和乳酸生成(通過(guò)細(xì)胞外酸化率(ECAR，糖酵解指數(shù))評(píng)估。Seahorse測(cè)量的OCR和ECAR的實(shí)時(shí)軌跡和平均數(shù)據(jù)如圖3A和3G所示。在心肌缺血30分鐘和再灌注24小時(shí)后，作者觀察到，與WT動(dòng)物相比，miR-210 KO小鼠心臟的基礎(chǔ)OCR和最大呼吸能力顯著且可重復(fù)地增加(圖3B和圖3C)。然而，與與質(zhì)子泄漏相關(guān)的OCR顯著增加(圖3E)相比，用于ATP生成的氧使用量顯著減少(圖3D)，從而導(dǎo)致能量生成的耦合效率顯著降低(圖3F)。與此同時(shí)，作者觀察到miR-210 KO小鼠的基礎(chǔ)ECAR和糖酵解能力降低(圖3H和3I)。miR-210缺陷對(duì)心臟線粒體生物能學(xué)的這些影響可通過(guò)miR-210模擬物恢復(fù)(圖3A-3I)。這些發(fā)現(xiàn)明確表明miR-210促進(jìn)線粒體代謝從氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?，從而微調(diào)心臟對(duì)急性IR和MI的反應(yīng)。

4. MiR-210在急性心臟IR損傷和心功能障礙中抑制線粒體ROS

在心臟缺血再灌注的情況下，miR-210可能作為一種穩(wěn)態(tài)機(jī)制來(lái)抑制線粒體生物能學(xué)和氧消耗，緩解電子傳遞和氧濃度的不匹配，并降低線粒體ROS (mtROS)通量。接下來(lái)，作者使用miR-210模擬物和miR-210 KO小鼠，通過(guò)功能獲得和功能喪失的方法，研究了miR-210在IR期間調(diào)節(jié)心臟mtROS生成中的機(jī)制聯(lián)系。MiR-210 KO和WT對(duì)照組小鼠采用缺血30 min再灌注24 h的方法，采用mtROS特異性熒光探針MitoSOX.20檢測(cè)心臟線粒體來(lái)源的ROS作者發(fā)現(xiàn)，在IR處理前1小時(shí)靜脈注射miR-210模擬物可阻斷KO小鼠心臟中mtROS的增加(圖4A)。與此一致，作者觀察到，在IR處理前15分鐘靜脈給予線粒體特異性抗氧化劑MitoQ (4 mg/kg)降低了WT小鼠心臟中的mtROS，并否定了miR-210 KO小鼠中增加的mtROS(圖4B)。然后，作者研究了MitoQ是否以及在多大程度上可以恢復(fù)miR-210缺陷對(duì)ir誘導(dǎo)的心肌梗死和心功能障礙的影響。作者發(fā)現(xiàn)，MitoQ減少了WT小鼠中IR誘導(dǎo)的MI，并否定了miR-210缺陷對(duì)IR介導(dǎo)的MI的影響(圖4C和4D)。與此同時(shí)，作者觀察到，在IR后3天的miR-210 KO小鼠中，MitoQ挽救了miR-210缺乏對(duì)LV EF和FS過(guò)度功能障礙的影響(圖4E和4F)。

圖4MiR-210抑制線粒體ROS在急性心臟缺血再灌注損傷和心功能障礙中發(fā)揮作用

接下來(lái)，作者檢測(cè)了通過(guò)MitoQ抑制mtROS的產(chǎn)生對(duì)WT和miR-210 KO小鼠心臟線粒體呼吸和糖酵解的影響。作者觀察到，在急性IR環(huán)境下，MitoQ對(duì)WT小鼠的基礎(chǔ)線粒體OCR和最大呼吸能力沒有顯著影響，但阻斷了miR-210缺陷對(duì)線粒體OCR的影響(圖5B和圖5C)。在WT動(dòng)物的心臟中，MitoQ顯著增加了用于ATP生成的氧使用量，降低了與質(zhì)子泄漏相關(guān)的OCR，并消除了miR-210缺乏的影響(圖5D和5E)。與此同時(shí)，盡管MitoQ抑制了線粒體呼吸，但它顯著提高了能量產(chǎn)生的耦合效率(圖5F)。此外，作者發(fā)現(xiàn)MitoQ降低了WT小鼠的基礎(chǔ)ECAR和糖酵解能力，并否定了miR-210缺乏對(duì)急性IR環(huán)境下心臟糖酵解的影響(圖5H和5I)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明MitoQ的保護(hù)作用是通過(guò)其對(duì)急性IR時(shí)心臟線粒體呼吸和mtROS生成的影響以及對(duì)糖酵解應(yīng)激的釋放來(lái)介導(dǎo)的。

圖5MitoQ挽救了miR-210缺乏對(duì)線粒體生物能學(xué)的影響

5. GPD2是miR-210控制心肌細(xì)胞mtROS的一個(gè)新靶點(diǎn)

作者首先研究了miR-210靶向GPD2轉(zhuǎn)錄本3 ' -非翻譯區(qū)(3 ' -UTR)的作用。圖6A描繪了miR-210靶向位點(diǎn)的GPD2 3 ' -UTR序列，以及miR-210沉默GPD2 mRNA翻譯的示意圖。作者使用序列對(duì)比程序MultAlin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)在GPD2 3 ' -UTR中確定了一個(gè)潛在的miR-210互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并使用rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合物免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明，與陰性對(duì)照處理的細(xì)胞相比，在miR-210模擬物轉(zhuǎn)染的小鼠新生心肌細(xì)胞中，GPD2 3 ' -UTR富集約5倍(圖6B)，這表明GPD2是miR-210的直接靶點(diǎn)。然后，作者在體外氧糖剝奪(OGD)模型中評(píng)估GPD2在miR -210介導(dǎo)的心肌細(xì)胞保護(hù)中的作用。作者首先證實(shí)，1% O2 OGD 2小時(shí)和復(fù)氧24小時(shí)顯著上調(diào)心肌細(xì)胞中miR-210的水平，這一上調(diào)被miR-210 LNA(圖6C)。作者發(fā)現(xiàn)，在ogd處理的心肌細(xì)胞中，miR-210 LNA抑制miR-210可上調(diào)GPD2蛋白豐度，而GPD2小干擾RNA處理可逆轉(zhuǎn)這一作用(圖6D)。miR-210 LNA顯著增強(qiáng)了OGD/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和乳酸脫氫酶釋放，用小干擾rna敲低GPD2可抵消這一作用(圖6E)，揭示了GPD2下調(diào)在miR-210介導(dǎo)的心肌細(xì)胞缺氧損傷保護(hù)中的作用。接下來(lái)，作者觀察到，與健康對(duì)照組相比，miR-210 LNA的存在增加了OGD/復(fù)氧處理的心肌細(xì)胞的mtROS(圖6F)。作者發(fā)現(xiàn)，敲低GPD2減少了OGD/復(fù)氧誘導(dǎo)的mtROS，并否定了miR-210 LNA對(duì)OGD/復(fù)氧介導(dǎo)的mtROS增加的作用(圖6F)。由于GPD2敲低抵消了miR-210抑制對(duì)mtROS生成增加和心肌細(xì)胞OGD/復(fù)氧損傷的影響，作者隨后研究了GPD2敲低對(duì)心肌細(xì)胞線粒體呼吸和糖酵解的影響。作者觀察到，在暴露于OGD/復(fù)氧的心肌細(xì)胞中，GPD2敲低對(duì)非線粒體呼吸和備用呼吸能力沒有顯著影響(數(shù)據(jù)未顯示)，但阻斷了miR-210抑制對(duì)線粒體OCR的影響(圖6G-6I)。此外，在OGD/復(fù)氧處理的心肌細(xì)胞中，GPD2敲低顯著增加了ATP生成過(guò)程中的氧使用，降低了與質(zhì)子泄漏相關(guān)的OCR，提高了線粒體能量生成的偶聯(lián)效率，并抵消了miR-210 LNA誘導(dǎo)的效應(yīng)(圖6J-6L)。同樣，作者發(fā)現(xiàn)GPD2敲低降低了OGD/復(fù)氧心肌細(xì)胞的糖酵解和糖酵解能力，并抵消了miR-210抑制的作用(圖6M-6O)。

圖6 MiR-210靶向GPD2抑制線粒體生物能學(xué)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞缺氧損傷

接下來(lái)，作者研究了MitoQ對(duì)心肌細(xì)胞缺氧損傷中miR210-GPD2-mtROS信號(hào)通路的線粒體的具體作用。作者發(fā)現(xiàn)，在ogd處理的心肌細(xì)胞中，用miR-210 LNA抑制miR-210顯著增加了線粒體中的ROS，這一過(guò)程被MitoQ特異性阻斷(圖7A和7B)。與之相對(duì)應(yīng)，MitoQ否定了miR-210 lna介導(dǎo)的OGD/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷增加(圖7C)，揭示了心肌細(xì)胞中miR-210信號(hào)通路中MitoQ作用于mtROS的機(jī)制聯(lián)系。鑒于miR-210 LNA在ogd處理的心肌細(xì)胞中上調(diào)GPD2蛋白豐度，作者隨后評(píng)估GPD2過(guò)表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞mtROS的具體影響。作者觀察到，與miR-210 LNA類似，GPD2過(guò)表達(dá)增加了OGD/復(fù)氧誘導(dǎo)的線粒體和心肌細(xì)胞損傷中的ROS，這一過(guò)程被MitoQ阻斷(圖7D-7F)。此外，作者發(fā)現(xiàn)在OGD/復(fù)氧處理的心肌細(xì)胞中，GPD2過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了線粒體OCR，降低了ATP生成的氧耗量，增加了與質(zhì)子泄漏相關(guān)的OCR，降低了線粒體能量生成的偶聯(lián)效率，并降低了糖酵解和糖酵解能力。重要的是，MitoQ消除了GPD2過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的效應(yīng)(圖S8)。因此，功能缺失和功能獲得的研究結(jié)果提供了明確的證據(jù)，表明GPD2在miR-210對(duì)心肌細(xì)胞mtROS生成的影響中起關(guān)鍵作用。

圖7MitoQ抑制miR-210 LNA和GPD2過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的mtROS生成和心肌細(xì)胞缺氧損傷

6. 敲低GPD2保護(hù)心臟并否定miR-210缺乏對(duì)IR損傷的影響

然后，作者確定了內(nèi)源性miR-210是否以及在多大程度上調(diào)控心臟中的GPD2。作者發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，miR-210 KO小鼠心臟中GPD2蛋白豐度顯著增加(圖8A)。miR-210 KO小鼠IR后4小時(shí)和24小時(shí)心臟中GPD2的增加分別維持和增強(qiáng)(圖8B)。作者在MI中驗(yàn)證了GPD2是miR-210的靶基因，并在缺血30分鐘再灌注24小時(shí)的心臟中證明了內(nèi)源性miR-210與GPD2的3 ' -UTR結(jié)合。在miR-210 mimic轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞中，miR-210與GPD2 3 ' -UTR的結(jié)合增加，這與miR-210 mimic轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞中miR-210與GPD2 3 ' -UTR的結(jié)合增加一致，IR顯著增加了心臟中miR-210與GPD2 3 ' -UTR的結(jié)合，而這在miR-210 KO小鼠中未觀察到(圖8C)。與此同時(shí)，在IR處理前靜脈給予miR-210模擬物降低了WT小鼠心臟中的GPD2蛋白豐度，并阻斷了miR-210缺乏對(duì)急性心臟IR中GPD2蛋白的影響(圖8D)。

在WT和miR-210 KO小鼠中，作者進(jìn)一步確定敲低GPD2是否以及在多大程度上抑制了ir誘導(dǎo)的mtROS生成和MI。作者首先驗(yàn)證了在接受急性IR治療的WT和miR-210 KO小鼠的心臟中，GPD2小干擾rna敲低GPD2蛋白的表達(dá)(圖8E)。然后，作者觀察到，在WT和KO小鼠中，敲低GPD2蛋白豐度降低了ir誘導(dǎo)的mtROS生成和MI，并否定了miR-210缺陷對(duì)增加mtROS生成和MI的影響(圖8F-8H)。與此同時(shí)，在心臟中敲低GPD2恢復(fù)了IR后3天miR-210 KO小鼠中觀察到的過(guò)度的LV EF和FS功能障礙(圖8I和8J)。

圖8敲低GPD2保護(hù)心臟，并抵消miR-210缺乏對(duì)IR損傷的影響

結(jié)論：

該研究在miR-210 KO小鼠中明確證明了內(nèi)源性miR-210在心肌梗死小鼠模型中保護(hù)心臟和改善心功能的作用。功能缺失和功能獲得的研究結(jié)果提供了明確的證據(jù)，表明miR-210在控制線粒體生物能學(xué)和ROS生成方面是必要和充分的，并支持miR-210在心臟IR損傷中保護(hù)心肌細(xì)胞能量的有益作用。該研究確定了GPD2在miR -210介導(dǎo)的心臟mtROS生成調(diào)控中的一個(gè)新的機(jī)制鏈接。該研究還揭示了MitoQ在抑制mtROS和維持線粒體ATP生成方面的復(fù)雜作用，并展示了MitoQ在治療缺血性心臟病和心力衰竭方面的治療潛力。

參考文獻(xiàn)：

Song R, Dasgupta C, Mulder C, Zhang L. MicroRNA-210 Controls Mitochondrial Metabolism and Protects Heart Function in Myocardial Infarction. Circulation. 2022 Apr 12;145(15):1140-1153.