ZNF334啟動(dòng)子的靶向DNA去甲基化抑制結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)

結(jié)直腸癌(CRC)是全球癌癥死亡的主要原因。腫瘤抑制基因或原癌基因啟動(dòng)子中DNA甲基化的異常調(diào)控是CRC發(fā)生和發(fā)展的基本過(guò)程之一。鋅指蛋白(ZNFs)是最豐富的蛋白質(zhì)群之一，在與腫瘤發(fā)生相關(guān)的許多重要生物學(xué)過(guò)程中起作用。我們?cè)?/span>CRC組織中檢測(cè)到與正常組織相比，ZNF334基因的異常高甲基化，這種修飾下調(diào)了ZNF334的表達(dá)。此外，TET1被鑒定參與調(diào)節(jié)ZNF334的甲基化水平。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明，靶向去甲基化系統(tǒng)上調(diào)了ZNF334的表達(dá)，抑制了CRC的生長(zhǎng)?？傊?，ZNF334啟動(dòng)子的靶向DNA去甲基化揭示了CRC的精確治療。本文于2023年3月發(fā)表于“Cell Death and Disease”（IF=9.685）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）CRC中ZNF334下調(diào)受DNA甲基化調(diào)控

為了研究CRC中ZNF334的特征，基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了在線分析。首先，我們利用TCGA項(xiàng)目中收集的泛癌視圖分析數(shù)據(jù)集，比較了ZNF334在24個(gè)腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常組織相比，大多數(shù)腫瘤組織中ZNF334表達(dá)降低，CRC組織中ZNF334表達(dá)下調(diào)存在顯著性差異(圖1A)。我們進(jìn)一步根據(jù)癌癥分期分析了ZNF334在CRC中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與正常組織相比，ZNF334在1期CRC中表達(dá)明顯下調(diào)，而在2、3、4期CRC中無(wú)明顯差異(圖1B)。同時(shí)，ZNF334基因啟動(dòng)子在人CRC組織中的甲基化程度明顯高于遠(yuǎn)端組織(圖1C)。為了進(jìn)一步研究ZNF334在CRC中的表達(dá)水平和啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，我們收集了93個(gè)包含臨床分期和預(yù)后的CRC組織，其中49個(gè)包含配對(duì)的相鄰正常組織。利用我院采集的組織進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)ZNF334，結(jié)果顯示97.96%的人結(jié)直腸癌組織中ZNF334較鄰近正常組織下調(diào)(圖1D)。惡性組織中甲基化率較高(圖1E)。事實(shí)上，ZNF334中CpG甲基化的平均百分比與其表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(圖1F)，表明DNA甲基化抑制了人類結(jié)直腸腫瘤中ZNF334的轉(zhuǎn)錄。接下來(lái)，根據(jù)中位數(shù)將ZNF334的表達(dá)和甲基化程度分為“高”和“低”。結(jié)果顯示，ZNF334 mRNA的表達(dá)是CRC患者預(yù)后的積極指標(biāo)(圖1G)，同時(shí)，ZNF334甲基化在CRC患者中具有預(yù)測(cè)作用(圖1H)。此外，還檢測(cè)了HCoEpiC和CRC細(xì)胞(HCT116、RKO、SW480和HT29)中ZNF334在mRNA水平上的表達(dá)。我們觀察到CRC細(xì)胞中ZNF334 mRNA的表達(dá)水平低于HCoEpiC(圖1I)。根據(jù)BSP測(cè)序，CRC細(xì)胞中有29個(gè)CpG位點(diǎn)高甲基化(圖1J)。這些結(jié)果表明，ZNF334在人結(jié)直腸腫瘤組織中的下調(diào)是DNA甲基化依賴的，ZNF334的表達(dá)和甲基化可能是CRC患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。

2）CRC中DAC和AZA誘導(dǎo)的去甲基化作用介導(dǎo)了ZNF334的上調(diào)

為了進(jìn)一步確定DNA甲基化在ZNF334下調(diào)中的潛在作用，我們使用兩種廣譜去甲基化劑AZA和DAC處理CRC細(xì)胞(HCT116、RKO、SW480和HT29)。采用CCK-8法檢測(cè)CRC細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示AZA和DAC處理的CRC細(xì)胞增殖活性降低，且增殖活性與AZA和DAC濃度呈負(fù)相關(guān)(圖2A, B)，同時(shí)我們觀察到AZA和DAC處理后的ZNF334 mRNA表達(dá)水平高于未處理的細(xì)胞(圖2C, D)。我們進(jìn)一步探索了AZA和DAC是否會(huì)影響體外CRC細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示AZA和DAC處理的HCT116細(xì)胞的凋亡率明顯高于對(duì)照組(圖2E)。BSP產(chǎn)物測(cè)序也顯示AZA和DAC處理的CRC細(xì)胞中ZNF334基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化降低(圖2F)。綜上所述，在CRC細(xì)胞中，DNA甲基化抑制了ZNF334的表達(dá)。

3）TET1刺激ZNF334的活性去甲基化

為了進(jìn)一步研究甲基化在CRC細(xì)胞中ZNF334失活中的作用，我們通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了HCoEpiC和CRC細(xì)胞(HCT116、RKO、SW480和HT29)中TET (TET1、TET2和TET3)的表達(dá)。結(jié)果顯示，TET1 mRNA在CRC細(xì)胞中的表達(dá)水平低于HcoEpiC細(xì)胞(圖3A)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與鄰近正常組織相比，54.02%的人結(jié)直腸腫瘤組織中的TET1水平下調(diào)(圖3B)。隨后選擇HCT116和RKO細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析，因?yàn)檫@兩種細(xì)胞中TET1表達(dá)較低。pLVX-MYRF-TET1感染HCT116和RKO細(xì)胞。qRT-PCR分析顯示，TET1在HCT116和RKO細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組(圖3C)。此外，TET1組顯著抑制了HCT116和RKO細(xì)胞的增殖(圖3D)。最后，qRT-PCR結(jié)果顯示，在CRC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TET1后，ZNF334的表達(dá)水平有效上調(diào)(圖3E)。綜上所述，TET1介導(dǎo)的DNA甲基化參與了ZNF334在CRC細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控。

4）體外ZNF334靶向去甲基化的抗腫瘤作用

為了通過(guò)特異性去甲基化逆轉(zhuǎn)ZNF334的表達(dá)，我們?cè)O(shè)計(jì)了5個(gè)sgRNAs，構(gòu)建了基于dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CDsgRNA的特異性去甲基化體系。通過(guò)將TET1的催化結(jié)構(gòu)域融合到用熒光報(bào)告GFP標(biāo)記的失活Cas9的N端來(lái)生成該體系(圖4A)。轉(zhuǎn)染dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334后，在HCT116細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到86.48%(圖4B)。qRT-PCR結(jié)果證實(shí)，在HCT116細(xì)胞中，ZNF334在mRNA水平上有效上調(diào)(圖4C)?；贐SP產(chǎn)物的測(cè)序也顯示，轉(zhuǎn)染dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334的CRC細(xì)胞中CpG甲基化降低(圖4D)。隨后，使用CCK-8方法測(cè)量HCT116細(xì)胞的增殖率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334顯著抑制了HCT116細(xì)胞的增殖(圖4E)。此外，dCas9multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334轉(zhuǎn)染組的HCT116細(xì)胞遷移量低于對(duì)照組(圖4F)。這些結(jié)果證明了ZNF334靶向去甲基化在CRC中的抗腫瘤作用。此外，通過(guò)任何基于cas9的技術(shù)在感興趣的基因組中識(shí)別脫靶切割是重要的。因此，我們使用COSMID在線工具選擇了前5個(gè)潛在的脫靶位點(diǎn)，以檢測(cè)它們的mRNA轉(zhuǎn)錄水平是否因脫靶去甲基化而改變(圖4G)。如圖4H所示，dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334組與dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgRNA及空白對(duì)照組之間，這些潛在脫靶基因的mRNA表達(dá)量均無(wú)明顯差異(圖4H)。這些結(jié)果表明dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334對(duì)ZNF334的去甲基化是有效和特異性的。

5）ZNF334靶向去甲基化抑制結(jié)直腸癌生長(zhǎng)

接下來(lái)，為了評(píng)估ZNF334靶向去甲基化對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的作用，將dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334或dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgRNA轉(zhuǎn)染的5 × 10⁶個(gè)HCT116細(xì)胞注射到雌性野生型(WT) BALB/c裸小鼠腹部，建立皮下腫瘤模型(圖5A)。我們的結(jié)果表明，ZNF334的靶向去甲基化顯著降低了HCT116細(xì)胞的腫瘤體積(圖5B)。靶向去甲基化ZNF334也顯著抑制了HCT116細(xì)胞的重量(圖5C)，此外，靶向去甲基化ZNF334后，HCT116腫瘤中凋亡細(xì)胞增多，增殖細(xì)胞減少(圖5D, E)。我們還通過(guò)內(nèi)皮特異性抗原CD31染色，確定了ZNF334的靶向去甲基化對(duì)腫瘤血管化的影響。如圖5E所示，用ZNF334的靶向去甲基化治療可顯著降低CD31染色(圖5F)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明，ZNF334的靶向去甲基化是治療CRC的一種潛在的抗腫瘤策略。

結(jié)論：

我們的研究表明，啟動(dòng)子區(qū)高DNA甲基化水平可下調(diào)ZNF334的表達(dá)，并參與CRC的發(fā)生。接下來(lái)，我們使用dCas9-multiGCN4/scFv-TET1CD-sgZNF334特異性下調(diào)ZNF334啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，這可以恢復(fù)ZNF334的表達(dá)，并在體外和體內(nèi)均具有顯著的抗腫瘤作用。綜上所述，我們探索了抑癌基因ZNF334在結(jié)直腸癌發(fā)生中的生物學(xué)作用，為結(jié)直腸癌的早期診斷和精準(zhǔn)治療提供了新的靶點(diǎn)和臨床依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

Yang B, Tang H, Wang N, Gu J, Wang Q. Targeted DNA demethylation of the ZNF334 promoter inhibits colorectal cancer growth. Cell Death Dis. 2023 Mar 25;14(3):210. doi: 10.1038/s41419-023-05743-x.