全基因組CRISPR篩選發(fā)現(xiàn)DOCK1抑制和二甲雙胍在肝癌中的合成致命性

二甲雙胍是多種癌癥強(qiáng)有力的候選抗腫瘤藥物。然而它的抗腫瘤效果在不同的癌癥或亞群中有所不同，這可能是由于腫瘤的異質(zhì)性。目前尚不清楚哪些肝細(xì)胞癌(HCC)患者亞群可以從二甲雙胍治療中受益。通過基于CRISPR-Cas9的全基因組敲除篩選，我們發(fā)現(xiàn)DOCK1水平?jīng)Q定了二甲雙胍的抗腫瘤作用，并且DOCK1是二甲雙胍在HCC中的合成致死靶點(diǎn)。在機(jī)制上，二甲雙胍促進(jìn)DOCK1磷酸化，激活RAC1促進(jìn)細(xì)胞存活，導(dǎo)致二甲雙胍耐藥。DOCK1選擇性抑制劑TBOPP通過二甲雙胍增強(qiáng)體外肝癌細(xì)胞系和患者來源的HCC類器官的抗腫瘤活性，并在體內(nèi)異種移植的肝癌細(xì)胞和免疫能力強(qiáng)的小鼠肝癌模型中增強(qiáng)抗腫瘤活性。二甲雙胍可以改善DOCK1低水平HCC患者的總生存期，但對DOCK1高表達(dá)患者沒有改善作用。這項(xiàng)研究表明，二甲雙胍的有效性取決于DOCK1的水平，二甲雙胍聯(lián)合DOCK1抑制可能為二甲雙胍耐藥的HCC患者提供一種有前途的個(gè)性化治療策略。本文于2022年11月發(fā)表于Protein&Cell(IF=15.328)。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

(1) CRISPR-Cas9文庫篩選確定DOCK1為二甲雙胍敏感性的決定因素

為了系統(tǒng)地識(shí)別對二甲雙胍治療敏感的肝癌亞型，我們采用了基于CRISPR-Cas9的負(fù)選擇方法來篩選那些損失會(huì)增強(qiáng)二甲雙胍抗腫瘤作用的基因。在二甲雙胍存在或不存在的情況下，用含有基因組級CRISPR敲除文庫(GeCKOv2)的慢病毒轉(zhuǎn)染的PLC/PRF/5細(xì)胞(PLC)進(jìn)行培養(yǎng)。孵育兩周后，基因組DNA被分離出來，高通量測序用于確定引導(dǎo)RNA的豐度，然后用MAGeCKFlute進(jìn)行進(jìn)一步分析(圖1A)。然而，在二甲雙胍治療組中，398個(gè)基因顯著減少(差異beta評分<?0.3)(圖1B)。為了確定哪些基因可能使PLC細(xì)胞對二甲雙胍敏感，但在未處理的細(xì)胞中沒有表現(xiàn)出明顯的生長障礙，我們使用對照組β-評分變化不超過0.15(?0.15<對照組β-評分<0.15)的附加標(biāo)準(zhǔn)縮小了候選基因。根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，398個(gè)基因中有171個(gè)被確定為候選基因(圖1C)，最終選擇其中6個(gè)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

接下來，為了驗(yàn)證篩選結(jié)果，我們定量了這6個(gè)候選細(xì)胞的mRNA表達(dá)，并測定了二甲雙胍在9種肝癌細(xì)胞中的半最大抑制濃度(IC50)值(圖1D和1E)。相關(guān)分析顯示DOCK1表達(dá)與二甲雙胍IC50值和AUC評分的Pearson相關(guān)系數(shù)最高(圖1F)，提示DOCK1表達(dá)水平可能決定了肝癌細(xì)胞對二甲雙胍的敏感性?？紤]到高差異beta評分及其與二甲雙胍反應(yīng)的強(qiáng)相關(guān)性，我們將重點(diǎn)放在DOCK1上進(jìn)行進(jìn)一步研究。

對指導(dǎo)RNA的分析顯示，在二甲雙胍處理的細(xì)胞中，所有六種靶向DOCK1的sgRNAs的豐度都較低(補(bǔ)充圖未展示)。與這些結(jié)果一致，DOCK1敲低導(dǎo)致PLC細(xì)胞在長期集落形成實(shí)驗(yàn)和IC50檢測中顯著敏化，以分析短期細(xì)胞活力(圖1G)。DOCK1的異位表達(dá)減弱了shDOCK1誘導(dǎo)的PLC細(xì)胞的二甲雙胍敏感性(圖1H)。此外，DOCK1的過表達(dá)消除了二甲雙胍在Huh7細(xì)胞中的抗腫瘤作用(圖1I)。綜上所述，這些結(jié)果表明DOCK1的表達(dá)水平?jīng)Q定了肝癌細(xì)胞對二甲雙胍的敏感性。

圖1：CRISPR-Cas9文庫篩選確定DOCK1為二甲雙胍敏感性的決定因素

(2) 抑制DOCK1使肝癌細(xì)胞在體內(nèi)和體外對二甲雙胍敏感

為了進(jìn)一步描述DOCK1在臨床前模型中確定二甲雙胍敏感性中的作用，我們建立了四種患者來源的HCC類器官(即1T、2T、3T和4T)用于進(jìn)一步的體外分析。進(jìn)一步的免疫組化染色顯示DOCK1在所有四個(gè)類器官及其相應(yīng)的腫瘤組織中表達(dá)一致(圖2A)。免疫組化染色和Western blot均顯示類器官1T和2T的DOCK1表達(dá)明顯高于3T和4T(圖2A和2B)。

為了研究HCC類器官對二甲雙胍的反應(yīng)，我們用增加劑量的二甲雙胍治療四個(gè)類器官。在二甲雙胍處理下，類器官3T和4T的類器官數(shù)量和大小比1T和2T減少得更多(圖2C)，表明敏感性更高，3T和4T的IC50值更低(圖2D)證實(shí)了這一點(diǎn)。為了研究DOCK1表達(dá)是否確實(shí)決定了患者來源的類器官中二甲雙胍的敏感性，我們在類器官1T和2T中通過shRNAs敲除DOCK1。與我們在PLC細(xì)胞中的觀察結(jié)果一致，DOCK1敲除在這些患者來源的HCC類器官中誘導(dǎo)二甲雙胍敏感性(圖2E-G)。此外，Ki67免疫熒光染色顯示，在DOCK1敲低的情況下，二甲雙胍能強(qiáng)烈抑制HCC類器官2T的增殖(補(bǔ)充圖未展示)。綜上所述，DOCK1表達(dá)水平有助于確定患者來源的HCC類器官的二甲雙胍敏感性。

為了研究這些體外研究結(jié)果是否可以在體內(nèi)重現(xiàn)，我們采用了YAP5SA誘導(dǎo)的HCC模型。為建立該模型，采用水動(dòng)力注射法將單轉(zhuǎn)座子YAP5SA和shDOCK1(或非靶向?qū)φ眨?/span>NTC)表達(dá)質(zhì)粒注入小鼠體內(nèi)。在一個(gè)月的生長后，小劑量的二甲雙胍(100mg/kg)每天口服給這些小鼠三個(gè)月。在NTC組中，低劑量二甲雙胍對腫瘤生長沒有影響，而在shDOCK1組中，該劑量二甲雙胍可顯著降低肝癌發(fā)病率，抑制腫瘤生長(圖2H)。與這些結(jié)果一致，Ki67免疫組化染色顯示二甲雙胍治療顯著抑制了表達(dá)shDOCK1的HCC腫瘤的增殖(補(bǔ)充圖未展示)。Western blot分析證實(shí)YAP1在腫瘤組織中過表達(dá)，DOCK1表達(dá)下調(diào)(圖2I)。此外，使用DOCK1敲低的PLC細(xì)胞進(jìn)行的小鼠異種移植實(shí)驗(yàn)表明，抑制DOCK1會(huì)增強(qiáng)二甲雙胍的抗腫瘤作用(圖2J、2K)?？偟膩碚f，DOCK1水平調(diào)節(jié)二甲雙胍對肝癌的抗腫瘤作用的強(qiáng)度，而在體外和體內(nèi)小鼠模型中，抑制DOCK1可使肝癌對二甲雙胍敏感。

圖2：抑制DOCK1使肝癌細(xì)胞在體內(nèi)和體外對二甲雙胍敏感

(3) RAC1激活導(dǎo)致DOCK1介導(dǎo)的癌細(xì)胞對二甲雙胍不敏感

為了探索DOCK1缺乏如何增強(qiáng)二甲雙胍的抗腫瘤作用，我們對表達(dá)NTC或shDOCK1的PLC細(xì)胞(PLC-NTC, PLC-shDOCK1細(xì)胞)在二甲雙胍存在或不存在的情況下進(jìn)行RNA-seq。在NTC細(xì)胞中，二甲雙胍改變了935個(gè)基因的表達(dá)，其中一些基因進(jìn)一步受到DOCK1抑制的影響(圖3A)。為了全面解釋DOCK1在二甲雙胍介導(dǎo)的癌癥抑制中的作用，我們分析了三組基因，包括NTC細(xì)胞中二甲雙胍上調(diào)的基因，以及相對于二甲雙胍處理的NTC細(xì)胞，在存在或不存在二甲雙胍時(shí)，shDOCK1下調(diào)的基因。這三組基因在功能上有大量的重疊(圖3B)。進(jìn)一步的基因本體(GO)和通路富集分析揭示了所有三組共有的18個(gè)GO術(shù)語或通路(圖3C)。在18個(gè)GO術(shù)語中，有4個(gè)術(shù)語與小的GTPase活性有關(guān)(圖3D)，這表明小的GTPase活性通路可能參與了DOCK1抑制誘導(dǎo)的癌細(xì)胞對二甲雙胍的增敏。

我們重點(diǎn)研究了RAC家族小GTPase信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。RAC與GTP結(jié)合時(shí)是活躍的，與GDP結(jié)合時(shí)是不活躍的。敲除DOCK1顯著降低了RAC1-GTP的水平。RAC1在細(xì)胞骨架組裝、腫瘤發(fā)生和腫瘤增殖中發(fā)揮重要作用，因此我們假設(shè)DOCK1缺乏通過抑制RAC1激活使癌細(xì)胞對二甲雙胍敏感。

Western blot顯示，二甲雙胍處理可導(dǎo)致PLC細(xì)胞中RAC1的激活，可見二甲雙胍存在時(shí)RAC1-GTP水平升高(圖3E)。在DOCK1敲低細(xì)胞中，二甲雙胍介導(dǎo)的RAC1激活被消除，這表明DOCK1是二甲雙胍激活RAC1所必需的(圖3F)。DOCK1的DOCK同源區(qū)-2(DHR2)結(jié)構(gòu)域直接與無核苷酸的RAC相互作用，誘導(dǎo)RAC的GTP負(fù)載，從而促進(jìn)其活化。因此，DHR2結(jié)構(gòu)域的缺失導(dǎo)致DOCK1功能的喪失。為了進(jìn)一步闡明shDOCK1是否通過其典型的GEF功能使癌細(xì)胞對二甲雙胍敏感，我們在內(nèi)源性DOCK1敲除的PLC細(xì)胞中異位表達(dá)攜帶DHR2結(jié)構(gòu)域缺失(DOCK1^△DHR2)的DOCK1。

為了進(jìn)一步測試RAC1激活是否對shDOCK1介導(dǎo)的二甲雙明敏化至關(guān)重要，我們在PLC-shDOCK1細(xì)胞中過表達(dá)野生型RAC1或RAC1G12V突變體(RAC1的組成活性形式)(圖3G)。集束形成實(shí)驗(yàn)顯示，RAC1G12V的表達(dá)部分減弱了PLC-shDOCK1細(xì)胞中增強(qiáng)的二甲雙胍敏感性，而野生型RAC1在PLC-shDOCK1細(xì)胞中僅顯示出可忽略的影響(圖3H)，這表明RAC1的激活有助于shDOCK1介導(dǎo)的癌細(xì)胞二甲雙胍敏化。

實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)和Western blot分析顯示，二甲雙胍對DOCK1的RNA或蛋白表達(dá)均無影響(圖3E)。二甲雙胍處理導(dǎo)致DOCK1酪氨酸殘基磷酸化增強(qiáng)(圖3I)，這增加了DOCK1的GEF活性。為了確定哪些特定的DOCK1酪氨酸殘基在暴露于二甲雙胍時(shí)被磷酸化，我們構(gòu)建了含有Y722F和Y1811F雙突變體的DOCK1Y722F/Y1811F質(zhì)粒。Western blot結(jié)果顯示，與野生型DOCK1相比，二甲雙胍誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化在DOCK1Y722F/Y1811F變體中顯著降低(圖3J)，這表明DOCK1Y722和Y1811殘基確實(shí)是二甲雙胍調(diào)控的磷酸化位點(diǎn)。

我們在PLC-shDOCK1細(xì)胞中異位表達(dá)了野生型DOCK1或DOCK1Y722F/Y1811F。Western blot結(jié)果顯示，二甲雙胍在表達(dá)野生型DOCK1的細(xì)胞中促進(jìn)了RAC1的激活，但在表達(dá)DOCK1Y722F/Y1811F突變體的細(xì)胞中沒有，這表明二甲雙胍激活RAC1需要在DOCK1的Y722和Y1811殘基磷酸化(圖3K)。DOCK1Y722F/Y1811F突變體的共表達(dá)也未能減弱shDOCK1誘導(dǎo)的癌細(xì)胞對二甲雙胍治療的致敏性(圖3L)。綜上所述，二甲雙胍在DOCK1的磷酸化中起作用，導(dǎo)致RAC1的激活，DOCK1的缺乏使癌細(xì)胞對二甲雙胍敏感。

圖3：通過DOCK1磷酸化激活RAC1有助于癌細(xì)胞對二甲雙胍不敏感

(4) TBOPP與二甲雙胍在體內(nèi)外的協(xié)同作用

1-(2-(30-(三氟甲基)-[1,10-聯(lián)苯]-4-基)-2-氧乙基)-5吡咯烷基磺酰-2(1H)-吡啶酮(TBOPP)是DOCK1的選擇性抑制劑。為了探索靶向DOCK1-RAC1軸的治療潛力，我們測試了TBOPP對癌細(xì)胞二甲雙胍毒性的影響。在0.75μmol/L或1μmol/L劑量下，TBOPP顯著抑制了RAC1的激活，但對PLC細(xì)胞的活力沒有影響(補(bǔ)充圖未展示)。然而，當(dāng)1mmol/L二甲雙胍與0.75μmol/L或1μmol/L TBOPP聯(lián)合處理PLC細(xì)胞時(shí)，在降低細(xì)胞活力方面有很強(qiáng)的協(xié)同作用(圖4A)。Western blot檢測RAC1-GTP顯示，在PLC細(xì)胞中，TBOPP減弱了二甲雙胍誘導(dǎo)的RAC1激活(圖4B)。我們分別使用1.5 μmol/L和7.5 μmol/LTBOPP聯(lián)合二甲雙胍治療類器官1T和2T。結(jié)果顯示，二甲雙胍或TBOPP單獨(dú)僅輕微抑制患者來源的HCC類器官的生長和增殖，而它們的聯(lián)合治療顯著降低了兩種HCC類器官的細(xì)胞活力(圖4C)，這表明二甲雙胍和TBOPP聯(lián)合使用具有強(qiáng)大的協(xié)同致死性。

接下來，我們使用PLC細(xì)胞進(jìn)行了小鼠異種移植實(shí)驗(yàn)。我們在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇了8 mg/kg TBOPP劑量，以探討其與二甲雙胍的聯(lián)合作用。8 mg/kg TBOPP聯(lián)合100 mg/kg二甲雙胍可顯著抑制PLC異種移植瘤生長，且不影響小鼠體重，進(jìn)一步證實(shí)了TBOPP與二甲雙胍的抗腫瘤協(xié)同作用(圖4D)。腫瘤組織裂解物的Western blot分析顯示，TBOPP治療明顯抑制二甲雙胍誘導(dǎo)的RAC1激活(圖4E)，這證實(shí)了RAC1激活有助于體內(nèi)癌細(xì)胞對二甲雙胍的DOCK1抑制相關(guān)的增敏。

為了進(jìn)一步證實(shí)TBOPP和二甲雙胍之間的協(xié)同作用，我們采用NRASG12V/shP53誘導(dǎo)的原位肝癌模型。二甲雙胍或TBOPP單藥治療只能提供適度的腫瘤抑制，而聯(lián)合治療在NRASG12V/shP53誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中具有很強(qiáng)的腫瘤抑制作用(圖4F)。我們使用Ki67染色進(jìn)一步證實(shí)了不同治療方法在腫瘤增殖方面的差異(圖4G)，Western blot顯示TBOPP在NRASG12V/shP53誘導(dǎo)的原位HCC模型中消除了二甲雙胍介導(dǎo)的RAC1激活(圖4H)?？偟膩碚f，在體外和體內(nèi)的幾個(gè)模型中，DOCK1抑制劑TBOPP與二甲雙胍在抑制肝癌方面產(chǎn)生了強(qiáng)烈的協(xié)同效應(yīng)。

圖4：TBOPP與二甲雙胍在體內(nèi)外的協(xié)同作用

(5) DOCK1水平?jīng)Q定肝癌患者中二甲雙胍的抗腫瘤活性

我們通過對122例臨床HCC合并糖尿病患者的回顧性評估，試圖確定DOCK1表達(dá)水平是否可以作為評估二甲雙胍在肝癌患者治療效果的潛在生物標(biāo)志物。這些患者被分為二甲雙胍使用組和其他抗糖尿病藥物使用組。我們進(jìn)行免疫組化染色以可視化和定量DOCK1的表達(dá)，并根據(jù)DOCK1的平均強(qiáng)度將患者分為DOCK1^Low(n=66)和DOCK1^High (n=56)兩類。二甲雙胍似乎能顯著提高DOCK1^Low患者的總生存期(圖5A)，而相比之下，二甲雙胍治療與DOCK1^High患者的不良預(yù)后相關(guān)(圖5B)。這些結(jié)果表明，二甲雙胍對患者的治療效果明顯相反，這取決于DOCK1水平是否相對低或高。對使用二甲雙胍的糖尿病HCC患者的進(jìn)一步分析顯示，DOCK1水平低的患者總生存率更好(圖5C)。在二甲雙胍治療的糖尿病HCC患者的樣本中，Ki67染色顯示，與DOCK1^High組相比，DOCK1^Low組的Ki67陽性細(xì)胞比例更低(圖5D)。綜上所述，DOCK1水平?jīng)Q定了二甲雙胍在HCC患者中的抗腫瘤效果。

為了驗(yàn)證這種可能性，我們接下來研究了DOCK1在HCC患者中的表達(dá)水平。肝癌標(biāo)本中DOCK1免疫組化染色定量分析顯示，腫瘤組織中DOCK1較鄰近正常組織上調(diào)(圖5E)。qPCR和Western blot分析顯示，與匹配的相鄰非癌性肝組織相比，HCC組織中DOCK1的RNA和蛋白質(zhì)水平均升高(圖5F和5G)。

DOCK1的高表達(dá)提示HCC患者二甲雙胍的療效可能較差。盡管DOCK1在HCC患者中廣泛表達(dá)上調(diào)，但腫瘤的異質(zhì)性仍然導(dǎo)致DOCK1在HCC樣本中的差異積累，一些患者表現(xiàn)出非常低的，甚至無法檢測到的DOCK1水平(圖5F)。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明，HCC患者應(yīng)根據(jù)其特定的DOCK1水平，強(qiáng)烈考慮采用個(gè)性化的精準(zhǔn)醫(yī)療方法。綜上所述，DOCK1在HCC中上調(diào)，其上調(diào)程度可決定二甲雙胍的抗腫瘤效果。

圖5：DOCK1水平?jīng)Q定肝癌患者中二甲雙胍的抗腫瘤活性

結(jié)論：我們的研究強(qiáng)調(diào)了DOCK1在決定肝癌細(xì)胞對二甲雙胍治療反應(yīng)中的作用，并說明了二甲雙胍在DOCK1低表達(dá)的肝癌患者中抑制腫瘤進(jìn)展。二甲雙胍-DOCK1抑制劑聯(lián)合治療DOCK1高表達(dá)肝癌患者的潛在有效性，這值得進(jìn)一步的臨床研究(圖6)。

圖6：工作模型：DOCK1通過DOCK1/RAC1軸決定二甲雙胍的抗腫瘤活性。

參考文獻(xiàn)：

Feng, J., Lu, H., Ma, W., Tian, W., Lu, Z., Yang, H., Cai, Y., Cai, P., Sun, Y., Zhou, Z., Feng, J., Deng, J., Shu, Y., Qu, K., Jia, W., Gao, P., & Zhang, H. (2022). Genome-wide CRISPR screen identifies synthetic lethality between DOCK1 inhibition and metformin in liver cancer. Protein & cell, 13(11), 825–841. https://doi.org/10.1007/s13238-022-00906-6.