eIF4E重編程可變剪接
異常剪接通常歸因于剪接因子（SF）突變，并與包括急性髓系白血?。?/span>AML）在內(nèi)的惡性腫瘤有關(guān)。發(fā)現(xiàn)了一種與突變無(wú)關(guān)的方法，即真核轉(zhuǎn)錄起始因子eIF4E，也能廣泛地重編程可變剪接（AS）。本文于2023年2月發(fā)表在《EMBO JOURNAL》期刊上。
技術(shù)路線：
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1、eIF4E過(guò)表達(dá)通過(guò)其RNA輸出功能影響剪接因子的蛋白水平
作為研究eIF4E在剪接中可能作用的第一步，作者檢查了先前收集的內(nèi)源性核eIF4E RIP-seq數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集來(lái)自侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤LY1細(xì)胞系，其中核eIF4E與約3000個(gè)轉(zhuǎn)錄本相關(guān)。作者分析顯示，eIF4E與約100個(gè)RNA相關(guān)，這些RNA編碼參與剪接調(diào)節(jié)的因子，其中53個(gè)RNA編碼主要剪接體的組分，包括SF3B1和U2AF1，這些因子在AML中經(jīng)常突變。有趣的是，STRING分析揭示所有主要的剪接復(fù)合體的顯著富集，根據(jù)剪接組的不同，FDR范圍從0.0016到2.19×10－49不等（圖1A）。這個(gè)結(jié)果促使作者分析內(nèi)源性eIF4E是否可以調(diào)節(jié)剪接因子的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)剪接。
為探究潛在的eIF4E剪接軸，作者基于以下幾個(gè)原因優(yōu)先使用U2OS細(xì)胞進(jìn)行研究。首先，與上述淋巴瘤細(xì)胞不同，U2OS細(xì)胞具有內(nèi)源性eIF4E水平，這與健康的志愿者細(xì)胞相似，使作者能夠測(cè)量eIF4E過(guò)表達(dá)的影響。其次，在細(xì)胞核中觀察到內(nèi)源性和過(guò)表達(dá)的eIF4E，這與剪接和細(xì)胞質(zhì)中的潛在作用一致（圖1B-H）。第三，eIF4E在這些細(xì)胞的capping、CPA、核RNA輸出和翻譯中發(fā)揮著公認(rèn)的cap - dependent作用。最后，淋巴瘤和U2OS細(xì)胞之間這些相互作用的保守性表明這是eIF4E的一般功能，而不是淋巴瘤特有的現(xiàn)象?？紤]到這些，作者生成了3個(gè)穩(wěn)定的2FLAG-eIF4E過(guò)表達(dá)或vector對(duì)照細(xì)胞株。首先確定eIF4E是否調(diào)節(jié)SFs的水平。WB顯示，在2FLAG-eIF4E細(xì)胞中，SF3B1、U2AF1、U2AF2、PRPF6、PRPF8、PRPF19、PRPF31、SNRNP200蛋白水平較Vector對(duì)照組升高約2 ~ 3倍（圖1C）。CyclinD1和Mcl1作為陽(yáng)性對(duì)照，而b-actin作為陰性對(duì)照，因?yàn)樗鼈儾皇莈IF4E的靶標(biāo)（圖1C）。與過(guò)表達(dá)相反，使用CRISPR-eIF4E或CRISPR-Ctrl U2OS細(xì)胞系檢測(cè)結(jié)果顯示內(nèi)源性eIF4E敲低會(huì)降低這些SFs的水平（圖1D）。這些發(fā)現(xiàn)表明內(nèi)源性eIF4E影響剪接機(jī)制的產(chǎn)生，因此，eIF4E對(duì)SFs的影響并不局限于以eIF4E升高為特征的環(huán)境?？傊?，eIF4E依賴的方式可以驅(qū)動(dòng)SFs的產(chǎn)生。eIF4E靶向的SFs存在于每個(gè)主要的剪接體復(fù)合體中（圖1A和1E）。
接下來(lái)探究eIF4E是否通過(guò)核輸出的機(jī)制影響SFs蛋白的產(chǎn)生。作者從核裂解物中進(jìn)行eIF4ERIP以確定eIF4E是否與U2OS細(xì)胞中SFs編碼的RNA結(jié)合。在IP過(guò)程中，核裂解物與甲醛交聯(lián)以防止重配，并通過(guò)RT-qPCR監(jiān)測(cè)RNA。觀察到含有SF3B1，SNRNP200，PRPF6，PRPF8，PRPF31，U2AF1，U2AF2的內(nèi)源性核eIF4ERIP相比于input，被富集了約2到4倍（圖1F）。鑒于這種相互作用，作者研究了這些SFs編碼RNA是否為eIF4E依賴核輸出的靶標(biāo)。為此，作者使用上述三種不同的細(xì)胞系，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)2FLAG-eIF4E細(xì)胞中相對(duì)于Vector對(duì)照的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)部分的RNA水平，發(fā)現(xiàn)它們都在eIF4E過(guò)表達(dá)后胞質(zhì)/核比率增加了~2倍，表明eIF4E過(guò)表達(dá)增加了它們的核輸出（圖1G）。分級(jí)質(zhì)控采用半定量PCR檢測(cè)U6snRNA和tRNAMet，其分別表示細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)部分（圖1G）?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明，eIF4E增強(qiáng)SFs編碼RNA核輸出，這為eIF4E介導(dǎo)的SFs蛋白產(chǎn)生的升高提供了一種機(jī)制。
除了通過(guò)核RNA輸出來(lái)驅(qū)動(dòng)SFs的產(chǎn)生外，eIF4E還可能間接驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄和/或改變SFs編碼RNA的轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性，作為驅(qū)動(dòng)其蛋白質(zhì)產(chǎn)生的平行手段。然而，作者注意到文獻(xiàn)中典型的eIF4E靶點(diǎn)，eIF4E過(guò)表達(dá)不調(diào)節(jié)任何RNA的總水平（圖1H）。因此，eIF4E不影響這些SF編碼轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄或RNA穩(wěn)定性。
圖1eIF4E通過(guò)其核運(yùn)輸活性改變SF景觀
為分析eIF4E依賴的RNA輸出與其翻譯功能對(duì)SF蛋白產(chǎn)生的相對(duì)貢獻(xiàn)，作者使用了一個(gè)功能分離突變體。eIF4ES53A突變體具有完全結(jié)構(gòu)，結(jié)合m7Gcap，促進(jìn)eIF4E依賴的翻譯和野生型eIF4E；然而，它不能促進(jìn)依賴eIF4E的核內(nèi)RNA輸出。作者比較了2FLAG-eIF4E、S53A突變體和Vector對(duì)照的SFs蛋白產(chǎn)量。檢測(cè)了每個(gè)細(xì)胞系的3個(gè)穩(wěn)定克隆，并注意到野生型和S53AeIF4E表達(dá)水平相似（圖2A）。正如預(yù)期的那樣，作為eIF4E-RNA輸出的既定目標(biāo)，如CCND1，S53A突變體不能刺激細(xì)胞cyclinD1蛋白的產(chǎn)生，其水平與Vector對(duì)照組相似，而在野生型eIF4E過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，其水平如預(yù)期的那樣升高。總之，對(duì)于所測(cè)試的SFs，S53A突變體沒(méi)有像野生型eIF4E那樣促進(jìn)蛋白表達(dá)，這證實(shí)了eIF4E在SFs蛋白升高中具有核輸出作用。
為更深入地研究一些SFs在RNA輸出和翻譯水平上共同調(diào)控的可能性，作者使用多聚體裝載來(lái)直接測(cè)量翻譯效率，即每個(gè)轉(zhuǎn)錄本裝載的核糖體數(shù)量（圖2B）。如預(yù)期的，2FLAG-eIF4E和Vector細(xì)胞的整體多核糖體特征是不可區(qū)分的（圖2B）。在較重的餾分中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本，每個(gè)轉(zhuǎn)錄本有更多的核糖體，因此比在較輕的餾分中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本翻譯效率更高。用RT-qPCR比較了2FLAG-eIF4E和Vector U2OS細(xì)胞系中單體、輕質(zhì)和重質(zhì)多核糖體部分的SF編碼RNA含量（圖2B）。預(yù)計(jì)在翻譯水平上受到影響的RNA在重核糖體部分會(huì)增加，同時(shí)在輕核糖體和單體部分會(huì)減少。發(fā)現(xiàn)ACTB mRNAs沒(méi)有因?yàn)閑IF4E的表達(dá)而發(fā)生改變，而陽(yáng)性對(duì)照MYC和VEGF則如預(yù)期的那樣轉(zhuǎn)移到較重的核糖體中。PRP31、U2AF1、SNRNP200或PRPF6轉(zhuǎn)錄物的核糖體負(fù)荷沒(méi)有變化。然而，PRPF8、SF3B1和U2AF2 mRNAs的特點(diǎn)是eIF4E依賴性地轉(zhuǎn)移到重多核糖體，并在輕核糖體和單體部分減少（圖2B，中間部分）。與S53A突變體觀察到的蛋白水平一致，觀察到這里的大多數(shù)eIF4E目標(biāo)是核輸出目標(biāo)；然而，少數(shù)目標(biāo)在輸出和翻譯水平上都對(duì)eIF4E敏感，使得它們對(duì)eIF4E水平更加敏感。
綜上所述，eIF4E與許多SF編碼RNA相互作用并促進(jìn)其核出口。此外，eIF4E并沒(méi)有調(diào)節(jié)這些轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄或穩(wěn)定性。對(duì)S53A突變體的研究強(qiáng)烈支持eIF4E的核RNA輸出功能在驅(qū)動(dòng)SF蛋白生產(chǎn)中的主要作用，但對(duì)一些SFs來(lái)說(shuō)，也有翻譯的貢獻(xiàn)，使這些后一種RNA對(duì)eIF4E失調(diào)更加敏感。
圖2分析S53AeIF4E突變體對(duì)其改變SF景觀能力的影響及其在翻譯中的作用
2、eIF4E在AML細(xì)胞系和原發(fā)性AML標(biāo)本中驅(qū)動(dòng)SFs的產(chǎn)生
為從遺傳學(xué)角度剖析eIF4E在AML背景下的作用，并與U2OS進(jìn)行比較，以確定這些eIF4E機(jī)制是否在不同的細(xì)胞類型中是保守的，構(gòu)建了eIF4E或Vector NOMO-1穩(wěn)定細(xì)胞系。NOMO-1 eIF4E細(xì)胞產(chǎn)生的eIF4E蛋白水平和定位與高eIF4E AML標(biāo)本相似（圖3A）。相比于對(duì)照組，這些SFs蛋白水平在NOMO-1 eIF4E細(xì)胞中上調(diào)（圖3A）。而使用eIF4E inhibitor ribavirin的效果則相反（圖3B）。因此，eIF4E對(duì)SFs的調(diào)控也適用于AML細(xì)胞。
接下來(lái)，研究原發(fā)性AML標(biāo)本中eIF4E狀態(tài)是否與SFs水平相關(guān)。如圖3C所示，結(jié)果和AML細(xì)胞類似，相比于健康或正常組，eIF4E高表達(dá)的AML患者組SFs蛋白水平顯著升高（圖3C）。因此，這些SF的升高并不是AML患者標(biāo)本的普遍特征，而是與eIF4E水平相關(guān)，這與在U2OS和NOMO-1細(xì)胞中的研究一致。
圖3eIF4E在AML中重編程SF景觀
隨后檢測(cè)eIF4E是否與SFs相互作用，為eIF4E可能影響剪接的提供額外手段。在RIPs之前，核裂解物用甲醛交聯(lián)，以防止處理過(guò)程中的重新組合。觀察到內(nèi)源性eIF4E與U1、U2、U4、U5和U6snRNAs免疫共沉淀，相比于input，在U2OS細(xì)胞（圖1F）以及NOMO-1細(xì)胞（圖3D）的核裂解物中富集了約3至10倍。內(nèi)源性eIF4E與陰性對(duì)照（GAPDH和ACTB）無(wú)關(guān)。此外，在U2OS或NOMO-1細(xì)胞中eIF4E過(guò)表達(dá)后，UsnRNAs的水平?jīng)]有改變，這表明eIF4E沒(méi)有導(dǎo)致更多剪接體的產(chǎn)生（圖1H和3E）。鑒于UsnRNAs在剪接體中發(fā)揮結(jié)構(gòu)和催化作用，作者研究了eIF4E是否與剪接體的蛋白質(zhì)組分物理相關(guān)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性eIF4E與U2OS（圖4A）和NOMO-1細(xì)胞（圖4B）中每個(gè)主要剪接體復(fù)合體的蛋白組分發(fā)生免疫沉淀，但不沉淀陰性對(duì)照。因此，正如在eIF4E依賴capping和CPA中觀察到的那樣，eIF4E促進(jìn)SFs的產(chǎn)生可能是為了增加其與它們的蛋白質(zhì)形式物理相互作用的能力?？傊琫IF4E與幾個(gè)主要剪接體的SF和UsnRNAs結(jié)合，并在AML和U2OS細(xì)胞環(huán)境中提高了SF蛋白水平。因此，eIF4E被定位為在不同的細(xì)胞環(huán)境中調(diào)節(jié)剪接，這表明這可能是eIF4E的一個(gè)廣泛適用的特性。
4、eIF4E與剪接體的相互作用是RNA和m7Gcap敏感的
如上文所述進(jìn)行免疫沉淀，只是由于RNAse步驟，U2OS細(xì)胞的核裂解物沒(méi)有甲醛交聯(lián)，然而，即使在沒(méi)有交聯(lián)的情況下，在未處理的對(duì)照組中，SFs和eIF4E之間也觀察到相同的相互作用（圖4A vs 4C）。觀察到SF3B1，U2AF1，U2AF2，PRPF6和PRPF8都存在于未處理的對(duì)照中，并且這種相互作用在RNAse處理后減少了約5倍（圖4C）。分離對(duì)照表明，作為核標(biāo)志物的Lamin在這些核裂解物中富集，而MEK1作為細(xì)胞質(zhì)標(biāo)志物缺乏，此外，在處理或未處理的樣本中，eIF4E均未與Lamin免疫沉淀（圖4C）。因此，eIF4E-SF相互作用需要完整的RNA。
考慮到RNAse處理同時(shí)針對(duì)底物m7Gcap的pre-mRNAs和UsnRNAs，作者研究了用m7Gcap的類似物處理的影響，這將破壞m7Gcap的mRNA相互作用而不影響UsnRNA介導(dǎo)的相互作用。進(jìn)行eIF4ERIPs作為m7GpppG或陰性GpppG對(duì)照的功能，并通過(guò)WB監(jiān)測(cè)SF的關(guān)聯(lián)（圖4D）。關(guān)于RNAse處理，核裂解物沒(méi)有甲醛交聯(lián)，eIF4E在m7GpppG或GpppG處理的樣品中都能免疫沉淀自身（圖4D）。此外，eIF4E-4EBP1的相互作用沒(méi)有受到m7GpppG或GpppG的影響，eIF4E-IP與陰性對(duì)照H2B也沒(méi)有影響。相對(duì)于GpppG對(duì)照組，eIF4E與PRPF6、U2AF3和SF3B1之間的相互作用被m7GpppG處理減少了2-5倍（圖4D）；此外，HuR/ ELAVL1-eIF4E復(fù)合物在m7GpppG處理下也減少了約5倍（圖4D）。鑒于eIF4E通過(guò)m7Gcap相互作用與大多數(shù)RNA相關(guān)，這些研究表明，eIF4E和SF的相互作用是由底物m7GcapRNA介導(dǎo)和/或穩(wěn)定的。這些結(jié)果表明，eIF4E招募了選定的m7Gcap的RNA到剪接體，并且/或者在那里穩(wěn)定了它們的相互作用。
圖4eIF4E以RNA和帽依賴的方式與剪接機(jī)制發(fā)生物理相互作用
5、單獨(dú)過(guò)表達(dá)eIF4E足以改變剪接程序
基于上述發(fā)現(xiàn)，作者監(jiān)測(cè)了eIF4E對(duì)U2OS細(xì)胞整體水平剪接的影響。使用rMATS，觀察到約760個(gè)轉(zhuǎn)錄物的約890個(gè)剪接事件被改變（FDR-adjusted P-value < 0.15; inclusion differences of > 0.05 or < 0.05），使用更嚴(yán)格的截?cái)嘀担≒value< 0.1, inclusion level differences of > 0.1 or < 0.1），觀察到493個(gè)轉(zhuǎn)錄物的555個(gè)剪接事件（圖5B）。在RNA-Seq實(shí)驗(yàn)中，共檢測(cè)到TPM大于10的5738個(gè)被注釋的轉(zhuǎn)錄物，表明約15%的被注釋的轉(zhuǎn)錄物是以eIF4E-dependent的方式進(jìn)行差異剪接的。SE是最頻繁的事件（約55%），其次是MXE事件（約30%）（圖5A）。聚類熱圖顯示所有類型的剪接事件僅基于eIF4E水平被分離（圖5B）。GO分析顯示，這些轉(zhuǎn)錄本參與的GO條目包括細(xì)胞周期、膜運(yùn)輸、DNA修復(fù)和微管細(xì)胞骨架組織。PPI富集分析與GO一致，排名靠前的是細(xì)胞周期，RNA代謝和膜運(yùn)輸（圖5C）。這些結(jié)果表明單獨(dú)過(guò)表達(dá)導(dǎo)致AS景觀改變。
圖5 eIF4E過(guò)表達(dá)驅(qū)動(dòng)了大規(guī)模的剪接重編程
6、在AML中eIF4E水平與差異剪接程序相關(guān)
接下來(lái)研究了eIF4E依賴性剪接在AML中的相關(guān)性，因?yàn)樵?/span>AML中用利ribavirin靶向eIF4E提供了臨床益處，包括在早期臨床試驗(yàn)中AML患者中的一部分得到緩解。第一步，作者分析了來(lái)自437份AML患者樣本和17份來(lái)源于人臍帶血的正常CD34+細(xì)胞樣本的RNA-Seq數(shù)據(jù)（圖6A-C）。通過(guò)RNA-Seq數(shù)據(jù)對(duì)樣本進(jìn)行了預(yù)篩選，以確保樣本不攜帶AML中報(bào)告的主要突變，即U2AF1、SRSF2或SF3B1的突變，使用正常CD34+細(xì)胞作為eIF4E水平基準(zhǔn)，將AML標(biāo)本分為高eIF4E組和正常eIF4E組（圖6A-B）。在rMATS分析中，選擇10個(gè)eIF4E水平最高的AML標(biāo)本和11個(gè)eIF4E水平正常的標(biāo)本，即與正常CD34+細(xì)胞中的水平重疊或低于其水平（圖6A-C）。相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)顯示，與11名eIF4E水平最低的AML患者（1396天，圖6C）相比，10名高eIF4E的AML患者的總生存期急劇下降（中位生存期136天，圖6C）。用rMATS比較這些高eIF4E和正常eIF4E標(biāo)本的剪接譜，觀察到~1,600個(gè)差異剪接事件，影響到~1,500個(gè)RNA（FDR-adjusted Pvalue< 0.1, absolute value of inclusion level differences of > 0.1），如果降低閾值（(absolute inclusion value difference of > 0.05 and FDR-adjusted Pvalue< 0.15），則有~12,000個(gè)差異剪接事件影響~4,600個(gè)轉(zhuǎn)錄物（圖6D）。對(duì)這些AS事件進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類分析，發(fā)現(xiàn)AML患者eIF4E表達(dá)狀態(tài)與MXE事件密切相關(guān)，在監(jiān)測(cè)MXE事件時(shí)，20/21例AML標(biāo)本的eIF4E水平是聚集的基礎(chǔ)（圖6E）。與U2OS細(xì)胞相似，觀察到eIF4E依賴的MXE靶點(diǎn)的前GO富集項(xiàng)與U2OS數(shù)據(jù)集中的高度相似：細(xì)胞周期，DNA修復(fù)，膜運(yùn)輸和RNA代謝，PPI富集于有絲分裂中心體、膜運(yùn)輸和notch信號(hào)通路（圖6F）。U2OS和AML數(shù)據(jù)集中所有eIF4E依賴的剪接靶點(diǎn)的交集獲得了一組核心的約450個(gè)常見(jiàn)RNA靶點(diǎn)（圖7A）。類似的，GO和PPI分析顯示它們也富集到細(xì)胞周期，DNA修復(fù)，膜運(yùn)輸，染色質(zhì)修飾，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，MYC激活等（圖7B）。
圖6 AML中eIF4E依賴的AS事件
7、eIF4E AS靶向的一個(gè)子集與核eIF4E發(fā)生物理相互作用
作者使用RT–qPCR驗(yàn)證了圖7A中核心拼接目標(biāo)中的幾個(gè)eIF4E誘導(dǎo)的可變剪接事件（圖7C）。作者調(diào)查了eIF4E是否在剪接體之前（或與剪接體一起）被招募到pre-mRNA上？或者這些eIF4E-轉(zhuǎn)錄物的聯(lián)系是否是剪接產(chǎn)物特異性的。為解決這個(gè)問(wèn)題，使用甲醛交聯(lián)進(jìn)行核eIF4ERIPs并使用特異性引物RT-qPCR分析RNA含量。結(jié)果與用底物和產(chǎn)物RNA的引物獲得的RNA的水平進(jìn)行了比較，后者作為正?；瘜?duì)照。觀察到，eIF4ERIPs與尚未經(jīng)歷目標(biāo)剪接事件（"未剪接"）的轉(zhuǎn)錄本，以及那些已經(jīng)經(jīng)歷了剪接事件（"已剪接"）的IL1B、IL4R、IKBKB、FAAP20和MAPK8IP3富集（圖7D）。這些發(fā)現(xiàn)表明eIF4E在至少某些剪接靶點(diǎn)的剪接中起直接作用。此外，這些研究首次表明eIF4E與pre-mRNA結(jié)合，這對(duì)eIF4E的功能具有重要意義。
圖7識(shí)別和驗(yàn)證核心剪接網(wǎng)絡(luò)以及與pre-mRNAs AS靶點(diǎn)的物理相互作用
總之，本研究證實(shí)，核eIF4E與SF編碼的RNA有物理聯(lián)系，并驅(qū)動(dòng)它們的核輸出，這些轉(zhuǎn)錄物的核輸出增強(qiáng)反過(guò)來(lái)又增加了它們對(duì)翻譯機(jī)器的可用性，并提高了SF蛋白的水平，并且eIF4E在整體水平重建了細(xì)胞SFs（圖7E）。
參考文獻(xiàn)：
Ghram M, Morris G, Culjkovic-Kraljacic B, Mars JC, Gendron P, Skrabanek L, Revuelta MV, Cerchietti L, Guzman ML, Borden KLB. The eukaryotic translation initiation factor eIF4E reprograms alternative splicing. EMBO J. 2023 Feb 27:e110496. doi: 10.15252/embj.2021110496. Epub ahead of print. PMID: 36843541.