BMP2/GDF5和BMP4/GDF5異源二聚體的形成和表征
實(shí)驗(yàn)方法：Western blots，細(xì)胞培養(yǎng)，熒光素酶報(bào)告分析，表面等離子體共振，非洲爪蟾發(fā)育測(cè)定，斑馬魚信號(hào)分析，晶體學(xué)，結(jié)構(gòu)分析與建模
TGFβ家族的蛋白質(zhì)主要作為同源二聚體被研究，也已知形成具有不同于其組成的同源二聚體的生物活性的異二聚體。例如，骨形態(tài)發(fā)生蛋白的異二聚體，包括BMP2/BMP7、BMP2/BMP6和BMP9/BMP10等，已經(jīng)說(shuō)明了這些異二聚蛋白在TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要性。在本研究中，我們確定了成熟的GDF5可以與成熟的BMP2或BMP4結(jié)合形成BMP2/GDF5和BMP4/GDF5異源二聚體。這種BMP2或BMP4單體與具有低硫酸肝素親和力的GDF5單體的組合產(chǎn)生了具有中等親和力的異源二聚體。使用肝素親和層析純化異質(zhì)二聚體蛋白，我們隨后確定BMP2/GDF5和BMP4/GDF5異質(zhì)二聚體在一系列細(xì)胞和體內(nèi)系統(tǒng)中始終有效地發(fā)出信號(hào)，而其同質(zhì)二聚體對(duì)應(yīng)物的活性則更多地依賴于環(huán)境。這些差異可能是由1型受體Alk3和Alk6的聯(lián)合親和力的增加所驅(qū)動(dòng)的。此外，測(cè)定了BMP2/GDF5異源二聚體的X射線晶體結(jié)構(gòu)，強(qiáng)調(diào)了兩個(gè)不對(duì)稱的1型受體結(jié)合位點(diǎn)的形成，這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)都是相對(duì)于同型二聚體獨(dú)特的。最終，這種異源二聚體生產(chǎn)方法獲得了一種相對(duì)于同型二聚體配體具有獨(dú)特性質(zhì)的信號(hào)分子，包括對(duì)多種1型的高親和力和中等的肝素結(jié)合親和力。本文于2023年2月發(fā)表于BMC Biology (IF=7.364)。
技術(shù)路線：
結(jié)果：
(1) GDF5/BMP2和GDF5/BMP4異源二聚體的產(chǎn)生和驗(yàn)證
由于BMP2和GDF5同型二聚體都可以通過(guò)細(xì)菌包涵體的氧化再折疊產(chǎn)生和純化，我們假設(shè)可以通過(guò)修改氧化再折疊方案來(lái)形成BMP2/GDF5異型二聚體。純化并溶解BMP2和GDF5包涵體，在氧化復(fù)折疊前以1:1的摩爾比混合。然后讓BMP2和GDF5的混合物再折疊5天。重折疊后，BMP2和GDF5同型二聚體通常通過(guò)肝素親和層析從不正確折疊的種中分離出來(lái)，其中BMP2二聚體用高鹽洗脫，而GDF5結(jié)合較弱，用低鹽濃度洗脫。我們假設(shè)異源二聚體可能對(duì)肝素表現(xiàn)出中間親和力。因此，我們將BMP2/GDF5的復(fù)折疊混合物應(yīng)用于肝素柱，在洗脫時(shí)確定了三個(gè)獨(dú)立的峰(圖1C)。SDS-PAGE和Western blots分析表明，在還原和非還原條件下，第一個(gè)峰含有GDF5同型二聚體，最后一個(gè)峰含有BMP2同型二聚體。中間峰由包含BMP2和GDF5鏈的單一二聚體組成(圖1C)。為了驗(yàn)證我們的異源二聚體形成方法，我們用BMP4和GDF5重復(fù)了這一過(guò)程。同樣，從肝素洗脫譜中鑒定出三個(gè)峰，中間的峰由BMP4/GDF5異源二聚體組成(圖1D)。這些結(jié)果表明，BMP2/GDF5和BMP4/GDF5異質(zhì)二聚體都可以通過(guò)氧化復(fù)折疊生成，并分離出同源性進(jìn)行進(jìn)一步分析。
圖1：天然BMP生產(chǎn)和異質(zhì)二聚體制造的原理圖
(2) 體外異二聚體和同二聚體信號(hào)的比較
先前對(duì)其他BMP異二聚體(特別是BMP2/7和BMP2/6)的研究發(fā)現(xiàn)，異二聚體往往比同源二聚體更能激活BMP信號(hào)。為了確定這是否適用于BMP2/GDF5和BMP4/GDF5異源二聚體，我們使用BRITER成骨細(xì)胞系測(cè)試了信號(hào)活性。BRITER細(xì)胞系通過(guò)SMAD 1/5/9表達(dá)熒光素酶以響應(yīng)BMP信號(hào)。在該檢測(cè)系統(tǒng)中，BMP2/GDF5和BMP4/GDF5異質(zhì)二聚體都是有效的信號(hào)分子，EC50值分別為1.7和1.1 nM(圖2)。與BMP2、BMP4或GDF5同質(zhì)二聚體相比，異質(zhì)二聚體的EC50值比所有同質(zhì)二聚體低約3-5倍(圖2)。此外，BMP2/GDF5和BMP4/GDF5異質(zhì)二聚體的信號(hào)比用等量的同質(zhì)二聚體BMP2+GDF5或BMP4+GDF5組合培養(yǎng)的細(xì)胞更強(qiáng)(圖2)。此外，在配體濃度較高時(shí)，異質(zhì)二聚體比各自的同質(zhì)二聚體表現(xiàn)出更大的信號(hào)。
圖2：異二聚體在體外比同二聚體更有效
(3) 異二聚體和同二聚體信號(hào)在體內(nèi)的比較
我們使用Xenopus顯影試驗(yàn)來(lái)測(cè)量BMP同二聚體與異二聚體的活性。重組配體或溶劑對(duì)照被微量注射到爪蛙囊胚的囊胚腔中，并允許它們發(fā)育約46小時(shí)，直到它們達(dá)到蝌蚪期(NF37期)，那時(shí)它們被評(píng)分為腹化。首先，進(jìn)行了劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，以確定引起具有最低致死率的表型的最小有效劑量；極度腹化胚胎在原腸形成時(shí)停止并隨后死亡(圖3A)。注射了0.15 pmol和0.5 pmol蛋白質(zhì)的胚胎使用背前指數(shù)(DAI)盲目評(píng)分，該指數(shù)可以測(cè)量胚胎腹化異常程度。在這個(gè)評(píng)分系統(tǒng)中，5分表示發(fā)育正常，0分表示腹化程度最嚴(yán)重(圖3D)。
與BMP2和BMP4相比，注射異二聚體的胚胎原腸發(fā)育停止和致死性更頻繁，并且略高于GDF5同型二聚體(圖3A)。GDF5同型二聚體比BMP2或BMP4造成更嚴(yán)重的腹化(圖3B, C)。這與體外系統(tǒng)相反，在體外系統(tǒng)中，BMP2是最有效的同型二聚體(圖2)。與GDF5類似，在所有測(cè)試濃度下，注射BMP2/GDF5或BMP4/GDF5異型二聚體與BMP2和BMP4同型二聚體相比，產(chǎn)生了劑量依賴性的腹化增加(圖3B, C)。
我們使用全坐位原位雜交方法，在注射后僅數(shù)小時(shí)，檢測(cè)了非洲爪蟾原腸胚形成期NF10期的一個(gè)亞群。在對(duì)照胚胎中，ventx1/2的表達(dá)僅限于發(fā)育中的原腸的最腹側(cè)(圖3E)。注射BMP2和BMP4導(dǎo)致ventx1/2的表達(dá)以劑量依賴的方式增加。相比之下，注射GDF5或BMP/GDF5異源二聚體可誘導(dǎo)ventx1/2表達(dá)域的劑量依賴性擴(kuò)張，從原腸頂部擴(kuò)散到背側(cè)(圖3E, F)。與BMP2和BMP4同型二聚體相比，BMP2/GDF5和BMP4/GDF5在體內(nèi)都具有高度活性(圖3B)。
重組配體(BMP2, GDF5和BMP2/GDF5)被注射到斑馬魚胚胎中，無(wú)論是WT還是缺乏BMP7的突變體(bmp7asb1aub)，以在受精后3小時(shí)(hpf)否定內(nèi)源性BMP信號(hào)。30分鐘后，注射的胚胎、未注射的WT和突變對(duì)照，通過(guò)免疫熒光定量核pSMAD5(圖4)。在未注射的野生型胚胎中有穩(wěn)健的信號(hào)傳導(dǎo)(圖4A)，但在未注射的BMP7突變型胚胎中沒(méi)有信號(hào)傳導(dǎo)(圖4B)。以實(shí)驗(yàn)確定的0.08 fmol劑量注射同型二聚體BMP2蛋白，以誘導(dǎo)輕度pSMAD5反應(yīng)(圖4C)，介于對(duì)照胚胎的兩個(gè)極端之間。與BMP2相比，在此劑量注射同型二聚體GDF5誘導(dǎo)的pSMAD5反應(yīng)較弱(圖4D)。相反，注射BMP2/GDF5異源二聚體比單獨(dú)注射同型二聚體誘導(dǎo)的pSMAD5反應(yīng)更強(qiáng)(圖4E, F)。這些結(jié)果表明，在該模型系統(tǒng)中，BMP2/GDF5異源二聚體比任何一種同型二聚體誘導(dǎo)的pSMAD5信號(hào)通路更強(qiáng)。
圖3：在非洲爪蟾發(fā)育試驗(yàn)中，異二聚體比BMP2和BMP4同二聚體信號(hào)更強(qiáng)
圖4：BMP2/GDF5異源二聚體信號(hào)在斑馬魚囊胚發(fā)育中比BMP2或GDF5同源二聚體更有效
(4) 同型二聚體和異型二聚體受體結(jié)合的比較
我們使用表面等離子體共振(SPR)和測(cè)量配體與蛋白A SPR芯片結(jié)合重組嵌合FC受體。對(duì)于1型受體Alk3和Alk6，使用1:1結(jié)合模型進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析以測(cè)量結(jié)合和擬合。圖5A中顯示了表觀平衡解離常數(shù)(KD)的比較。GDF5對(duì)Alk6 (57 pM)的親和力遠(yuǎn)高于Alk3 (328pM)。BMP4對(duì)Alk3 (72 pM)和Alk6 (113 pM)的親和力相似，但對(duì)Alk3的偏好性較弱。BMP2優(yōu)先與Alk3 (26 pM)結(jié)合，但也保留了與Alk6 (102 pM)結(jié)合的能力(圖5A)。對(duì)于所有三種同型二聚體，較低的結(jié)合親和力主要是由解離率的增加所驅(qū)動(dòng)，因?yàn)殛P(guān)聯(lián)率相似(圖5A)。BMP2/GDF5和BMP4/GDF5異源二聚體對(duì)Alk3和Alk6都顯示出高親和KD值，且相應(yīng)的解離速率較慢(圖5A)。BMP2/GDF5與Alk3結(jié)合的親和力為32 pM，與Alk6結(jié)合的親和力為26 pM。類似地，BMP4/GDF5與Alk3結(jié)合的表觀親和力為29 pM，與Alk6結(jié)合的表觀親和力為46 pM(圖5A)。實(shí)際上，異二聚體保留了它們單體組分的高親和力，導(dǎo)致分子與更大的受體庫(kù)具有特別高的結(jié)合親和力。此外，我們還測(cè)試了這些蛋白質(zhì)與Alk2 (BMP6和BMP7的首選目標(biāo))或Alk1(與BMP9和BMP10結(jié)合)結(jié)合的能力。
我們使用SPR來(lái)確定BMP配體和2型受體之間的相對(duì)結(jié)合親和力。由于2型受體的結(jié)合位點(diǎn)被分離到單個(gè)鏈上，我們假設(shè)異二聚體對(duì)2型受體具有與同源二聚體相當(dāng)?shù)挠H和力。與1型受體相比，這種快速的解離與BMP配體對(duì)2型受體的親和力明顯較弱相一致，這意味著更短暫的相互作用。這些極快的締合和解離速率足夠接近于漸近，以至于分析軟件無(wú)法使用動(dòng)力學(xué)模型擬合數(shù)據(jù)。因此，對(duì)這些SPR數(shù)據(jù)集進(jìn)行了穩(wěn)態(tài)結(jié)合分析，以確定表觀結(jié)合親和力。
圖5：SPR測(cè)定1型和2型受體親和力
(5) BMP同二聚體和異二聚體拮抗作用的比較
由于BMP配體受到細(xì)胞外蛋白拮抗劑的高度調(diào)控，我們接下來(lái)想確定異質(zhì)二聚體是否受到BMP拮抗劑的差異調(diào)控。已有研究表明，BMP2/BMP7異源二聚體不被細(xì)胞外拮抗劑Noggin中和，而Noggin已知能有效拮抗BMP2和BMP7同源二聚體。對(duì)于BMP異質(zhì)二聚體療效的增加，特別是在體內(nèi)，一種可能的解釋可能與細(xì)胞外拮抗劑的活性有關(guān)。我們使用BRITER熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)測(cè)試了幾種不同的細(xì)胞外蛋白拮抗劑(具有不同的結(jié)合方式和配體偏好)對(duì)BMP信號(hào)通路的影響。具體來(lái)說(shuō)，我們測(cè)試了Noggin、Grem2和NBL1。Grem2和Noggin在低濃度時(shí)都能有效拮抗BMP2和BMP4，IC50濃度約為1 nM，而抑制GDF5信號(hào)則需要更高的濃度，Grem2的IC50為38 nM，Noggin的IC50為42 nM (圖6)。Noggin和Grem2均可拮抗BMP2/GDF5和BMP4/GDF5異源二聚體，拮抗?jié)舛扰c抑制BMP2和BMP4所需的濃度相似(圖6)。雖然NBL1對(duì)異源二聚體的拮抗程度略高，尤其是BMP2/GDF5(圖6)，但NBL1對(duì)所有檢測(cè)蛋白的拮抗作用相對(duì)較弱。這些結(jié)果表明，BMP2/GDF5和BMP4/GDF5異質(zhì)二聚體都被已知的靶向BMP同型二聚體的細(xì)胞外拮抗劑有效抑制，并且與這些拮抗劑的不同相互作用不太可能導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中觀察到的活性差異。
圖6：蛋白質(zhì)拮抗劑對(duì)異質(zhì)二聚體和同源二聚體抑制活性的比較
(6) BMP2/GDF5異源二聚體的晶體結(jié)構(gòu)
我們改進(jìn)的氧化復(fù)折疊方案有效地產(chǎn)生毫克量的BMP2/GDF5。使用這種蛋白質(zhì)，我們能夠很容易地解決BMP2/GDF5的X射線晶體結(jié)構(gòu)，分辨率為2.8 ?(圖7A)。這使我們有機(jī)會(huì)直接交叉比較異質(zhì)二聚體的結(jié)構(gòu)與先前解決的BMP2和GDF5同型二聚體的結(jié)構(gòu)。BMP2/GDF5異源二聚體顯示出BMP生長(zhǎng)因子的特征形狀，然而，二聚體清楚地顯示出不對(duì)稱的外觀(圖7A)。這與所有已發(fā)表的BMP配體結(jié)構(gòu)形成鮮明對(duì)比，包括載脂蛋白結(jié)構(gòu)和包含其他蛋白質(zhì)結(jié)合伙伴的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，它們保持相同的基本對(duì)稱形狀。因此，在許多先前的結(jié)構(gòu)中，不對(duì)稱單位只包含配體的一半。由于配體的不對(duì)稱性，不對(duì)稱單元由兩個(gè)完整的二聚體組成。對(duì)于171 Cα，兩種二聚體的RMSD為0.28，表明每種二聚體的晶體填充方式不同，對(duì)每種配體的整體形狀影響不大。
異質(zhì)二聚體和同質(zhì)二聚體結(jié)構(gòu)之間的顯著差異發(fā)生在手指的彎曲上。與apo-BMP結(jié)構(gòu)相比，異質(zhì)二聚體的BMP2一半在形成BMP折疊的“手指”的β-鏈中顯示出更小的曲率。當(dāng)使用DynDom(可以用來(lái)測(cè)量結(jié)構(gòu)之間疇向的差異)進(jìn)行分析時(shí)，異源二聚體結(jié)構(gòu)的曲率下降了23°，鉸鏈點(diǎn)位于“手指”區(qū)域，從二聚體二硫半胱氨酸測(cè)量到19 ?(圖6B)。相反，與apo-GDF5相比，GDF5一半的β鏈曲率略有增加(圖6B)。在這里，分歧點(diǎn)(“鉸鏈”)發(fā)生在非常接近“指尖”的尖端，27 ?遠(yuǎn)離中央二硫鍵，最大限度地減少了與apo-GDF5結(jié)構(gòu)不同的殘基數(shù)量。因此，異質(zhì)二聚體的手指可以被描述為在BMP2側(cè)打開，在GDF5側(cè)關(guān)閉。手指在二聚體上曲率的整體差異是生長(zhǎng)因子形狀不對(duì)稱的原因。
圖7：BMP2/GDF5異源二聚體的結(jié)構(gòu)及1型受體結(jié)合位點(diǎn)與同源二聚體的比較
(7) 表面靜電分析
BMP2/GDF5異質(zhì)二聚體與BMP2和GDF5同型二聚體之間的肝素/HS結(jié)合親和力差異最初是在我們的蛋白質(zhì)生產(chǎn)方案中觀察到的，其中肝素親和層析用于將異質(zhì)二聚體與同型二聚體分離。當(dāng)比較同型二聚體和異型二聚體結(jié)構(gòu)的溶劑靜電勢(shì)時(shí)，可以觀察到這種差異。帶正電的表面(藍(lán)色)對(duì)應(yīng)于帶正電的殘基簇，包括精氨酸和賴氨酸，并與肝素/HS結(jié)合區(qū)域密切相關(guān)(圖8)。BMP2的HS結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)確定地定位于成熟多肽的N端、面向細(xì)胞的蛋白質(zhì)基部的賴氨酸和精氨酸殘基斑塊(QAKHKQRKRLK-) (圖7C和8，底部)。BMP4和BMP2都有三個(gè)連續(xù)長(zhǎng)度的堿性氨基酸，在BMP4的情況下，這被證明是肝素結(jié)合的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素(圖7C)。GDF5具有與BMP2和BMP4相似數(shù)量的賴氨酸和精氨酸殘基，但它們分布在較長(zhǎng)的N端延伸處，導(dǎo)致局部正電荷濃度較低(圖7C)。此外，GDF5在二聚體的底部帶極負(fù)電荷，這可能抵消了在表面正面觀察到的較小陽(yáng)性斑塊的影響(圖8)。GDF5較低的肝素結(jié)合親和力導(dǎo)致報(bào)道的哺乳動(dòng)物血清水平比其他BMP高10-20倍。利用晶體結(jié)構(gòu)分析了BMP2/GDF5異質(zhì)二聚體的靜電表面。該分析表明，BMP2/GDF5異源二聚體在該位點(diǎn)上顯示了一個(gè)更中性的表面，并從其BMP2的一半保留了足夠的正電荷殘基，以形成一個(gè)更有限的肝素/HS結(jié)合基元，這與其觀察到的中間肝素結(jié)合親和力一致(圖1和8C)。
圖8：BMP2/GDF5與各自同型二聚體的靜電比較
(8) BMP2/GDF5結(jié)構(gòu)中的1型結(jié)合位點(diǎn)分析
之前的結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明了Alk3和Alk6分別如何與BMP2和GDF5結(jié)合。這兩種配體之間有許多相似之處：受體復(fù)合物結(jié)構(gòu)，結(jié)合位置保守，疏水相互作用主導(dǎo)界面，包括疏水三聯(lián)體位于一個(gè)單體的凹指區(qū)和第二個(gè)單體的腕螺旋面(圖7C)。類似的氫鍵也能促進(jìn)受體結(jié)合(圖7C)。在BMP2的L333的主干和Alk3的Q109之間形成了一個(gè)關(guān)鍵的氫鍵，當(dāng)突變?yōu)楦彼釙r(shí)，該氫鍵被干擾，導(dǎo)致受體結(jié)合和信號(hào)傳導(dǎo)消融。這種特殊的氫鍵在GDF5與Alk6結(jié)合的結(jié)構(gòu)中也很明顯，盡管其必要性尚未得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。受體結(jié)合界面的這些相似性被認(rèn)為是通過(guò)Alk3和Alk6的BMP2信號(hào)，在很大程度上可以互換。然而，一個(gè)關(guān)鍵的區(qū)別，也是GDF5對(duì)Alk3的親和力明顯低于Alk6的原因，是緊跟著這個(gè)關(guān)鍵氫鍵在L333 (GDF5中的L451)的殘基之間的差異，即BMP2中的Ala和GDF5中的Arg。BFGW結(jié)合位點(diǎn)可能優(yōu)先與Alk6而不是Alk3結(jié)合。事實(shí)上，Alk3和Alk6在該位點(diǎn)的疊加表明R438會(huì)與Alk3發(fā)生立體碰撞，就像在同型二聚體GDF5中一樣。然而，由于手指曲率的差異，1型位點(diǎn)更加開放，這使得幾個(gè)疏水殘基遠(yuǎn)離疊加受體。因此，雖然BFGW位點(diǎn)保留了GDF5的歧視性R438殘基，但口袋的整體形狀更加開放，這可能使受體的定位與同源二聚體略有不同。GFBW結(jié)合位點(diǎn)的功能可能類似于同二聚體BMP2，對(duì)Alk3的偏好超過(guò)Alk6，并且能夠通過(guò)這兩個(gè)受體發(fā)出強(qiáng)烈的信號(hào)。
我們?cè)噲D獲得關(guān)于異源二聚體中每個(gè)獨(dú)特位點(diǎn)的受體特異性的實(shí)驗(yàn)信息，并研究BFGW結(jié)合口袋中Alk3親和力增加的可能性。我們利用了BMP2突變L333P，它破壞了1型受體的結(jié)合，以破壞異質(zhì)二聚體一半上的受體結(jié)合。首先，產(chǎn)生具有L333P突變的BMP2同型二聚體作為對(duì)照，并在熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)中顯示不發(fā)出信號(hào)。使用L333P BMP2，我們與WT GDF5形成并分離了一個(gè)異源二聚體，預(yù)計(jì)它的一半(GFBW)上有一個(gè)中斷的1型受體結(jié)合，在另一邊(BFGW)上留下一個(gè)單一的功能位點(diǎn)。采用1:1結(jié)合模型，突變異質(zhì)二聚體BMP2_L333P/GDF5與Alk3和Alk6結(jié)合的親和力遠(yuǎn)低于同型二聚體GDF5，與僅具有單一1型受體結(jié)合位點(diǎn)的突變體一致。雖然在該結(jié)合系統(tǒng)中很難區(qū)分親和性和親和性的影響，但Alk3和Alk6結(jié)合的相對(duì)減少是相似的。因此，異二聚體對(duì)1型受體整體親和力的增加可能是由于在一個(gè)信號(hào)配體中有兩個(gè)不同的高親和力位點(diǎn)，其中一側(cè)表現(xiàn)為GDF5配體，另一側(cè)表現(xiàn)為BMP，特異性由手腕區(qū)域決定。我們無(wú)法通過(guò)破壞BFGW位點(diǎn)來(lái)復(fù)制這些發(fā)現(xiàn)，因?yàn)镚DF5突變不能正確地折疊。
結(jié)論：我們開發(fā)了新的BMP2/GDF5和BMP4/GDF5異源二聚體，它們比同源二聚體BMP2，BMP4更有效地發(fā)出信號(hào)。異質(zhì)二聚體顯示出肝素親和力的差異，并可能保留類似于GDF5的更高擴(kuò)散勢(shì)。
參考文獻(xiàn)：Gipson, G. R., Nolan, K., Kattamuri, C., Kenny, A. P., Agricola, Z., Edwards, N. A., Zinski, J., Czepnik, M., Mullins, M. C., Zorn, A. M., & Thompson, T. B. (2023). Formation and characterization of BMP2/GDF5 and BMP4/GDF5 heterodimers. BMC biology, 21(1), 16. https://doi.org/10.1186/s12915-023-01522-4.