SIRT6調(diào)節(jié)的巨噬細(xì)胞胞葬表觀遺傳控制糖尿病牙周炎的炎癥消退

       ? 糖尿病是一種以胰島素抵抗、高血糖和炎癥紊亂為特征的疾病，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的牙周炎。與慢性牙周炎（CP）相比，糖尿病性牙周炎（DP）對(duì)牙周組織的破壞更為嚴(yán)重。DP的高糖環(huán)境會(huì)導(dǎo)致宿主免疫炎癥反應(yīng)失調(diào)，從而引發(fā)持續(xù)炎癥，加速牙周破壞。糖尿病患者的慢性不愈合或愈合緩慢的傷口通常與長(zhǎng)期炎癥和中性粒細(xì)胞持續(xù)性有關(guān)。此外，隨著胞葬的生物學(xué)行為，巨噬細(xì)胞分泌大量抗炎分子，表明這一過(guò)程是促進(jìn)炎癥消退和組織修復(fù)所必需的。新出現(xiàn)的證據(jù)強(qiáng)調(diào)了胞葬受損在多種炎癥性疾病中的作用，而胞葬在DP中的生理功能尚未完全確定。SIRT6作為一種NAD依賴性組蛋白去乙?；福谔谴x、炎癥穩(wěn)態(tài)和長(zhǎng)壽中具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。髓細(xì)胞特異性SIRT6缺乏通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型，延遲高脂飲食小鼠的傷口愈合并引起胰島素抵抗。此外，對(duì)糖尿病患者的研究表明，SIRT6在許多人體組織中表達(dá)不足，這表明SIRT6對(duì)糖尿病相關(guān)疾病具有保護(hù)作用。因此，探索SIRT6調(diào)控免疫穩(wěn)態(tài)的潛在機(jī)制，可能對(duì)DP患者實(shí)現(xiàn)良好的牙周組織保存具有重要的臨床意義。該研究發(fā)表于《Theranostics》，IF：11.6。
技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：
1. 人DP中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的特征分布
       為了探索糖尿病相關(guān)炎癥性疾病中細(xì)胞群組成和調(diào)節(jié)細(xì)胞通路的差異，作者在單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集GSE165816中分析了來(lái)自健康非糖尿病和糖尿病足潰瘍非愈合者的足部皮膚樣本。GO富集分析結(jié)果顯示，炎癥和細(xì)胞凋亡相關(guān)通路被激活（圖1A, B）。在鑒定的炎癥細(xì)胞中，作者重點(diǎn)關(guān)注巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，并通過(guò)GO分析和統(tǒng)一流形逼近與投影（UMAP）分析進(jìn)一步鑒定巨噬細(xì)胞簇的細(xì)胞群。值得注意的是，UMAP分析顯示巨噬細(xì)胞異常極化（圖1C）。GO富集分析顯示，與非糖尿病對(duì)照的巨噬細(xì)胞相比，糖尿病巨噬細(xì)胞中與免疫應(yīng)答、吞噬、遷移能力和葡萄糖代謝相關(guān)的通路出現(xiàn)異常（圖1D, E）。這些結(jié)果表明，糖尿病創(chuàng)面愈合過(guò)程中異常炎癥反應(yīng)可能是由于細(xì)胞凋亡相關(guān)通路大量激活，巨噬細(xì)胞吞噬能力異常所致。
       為了進(jìn)一步探討DP持續(xù)升高的炎癥是否與巨噬細(xì)胞吞噬能力異常有關(guān)，作者收集了伴有或不伴有糖尿病的牙周炎患者的牙齦樣本（圖1F）。在牙周炎中，巨噬細(xì)胞引起的中性粒細(xì)胞胞葬被認(rèn)為是抗炎和促進(jìn)消退的事件。糖尿病的慢性炎癥通常很嚴(yán)重且很難治愈。因此，作者首先檢測(cè)了牙齦中的中性粒細(xì)胞，結(jié)果顯示DP組的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（CD15）細(xì)胞數(shù)量高于CP組（圖1G, L）。使用牙齦組織連續(xù)切片進(jìn)行TUNEL染色，結(jié)果顯示DP組的牙齦組織中有大量凋亡細(xì)胞，而CP組幾乎未見(jiàn)凋亡細(xì)胞（圖1H, M）。通過(guò)對(duì)相同位點(diǎn)的連續(xù)切片的比較觀察，作者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)凋亡細(xì)胞為CD15中性粒細(xì)胞（圖1G, H）。隨后，作者利用MPO和H3CIT標(biāo)記物中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）發(fā)現(xiàn)，DP中中性粒細(xì)胞的過(guò)度積累和延遲清除導(dǎo)致大量NETs的形成（圖1I, N），從而加重了糖尿病患者的炎癥并延遲了炎癥的消退。為了進(jìn)一步探討未及時(shí)清除的凋亡中性粒細(xì)胞是否由巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)異常引起，作者對(duì)巨噬細(xì)胞極化進(jìn)行免疫熒光染色。DP組牙齦中巨噬細(xì)胞（CD68）的浸潤(rùn)量遠(yuǎn)高于CP組（圖1O）。DP組CD68 CD86陽(yáng)性M1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)量高于CP組（圖1J, P），CD68 CD206陽(yáng)性M2極化巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)量DP組與CP組無(wú)差異（圖1K, Q），但DP組M2/M1比值明顯低于CP組（圖1R）。綜上所述，凋亡中性粒細(xì)胞和NETs的過(guò)度積累和延遲清除，伴隨著巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加和巨噬細(xì)胞極化破壞，無(wú)疑加重了DP炎癥。

圖1 人DP中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的特征分布

2. 功能失調(diào)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞加重了小鼠DP的炎癥損傷并損害炎癥消退
       為了探討糖尿病對(duì)牙周炎進(jìn)展和炎癥消退的影響，作者使用了兩種經(jīng)典的結(jié)扎性牙周炎（LIP）小鼠模型，即牙周炎模型和牙周炎消退模型。牙周炎模型結(jié)扎過(guò)程長(zhǎng)達(dá)14天，牙周炎消退模型小鼠結(jié)扎7天，然后拆除結(jié)扎物，再模擬7天的炎癥消退過(guò)程（圖2A）。在牙周炎和牙周炎消退模型中，糖尿病小鼠從CEJ到ABC的距離都明顯增加（圖2B, I）。在牙周炎和牙周炎消退模型中，與CP組相比，糖尿病小鼠表現(xiàn)出更高的破骨細(xì)胞活性，TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞表面出現(xiàn)更高（圖2C, J）。此外，在DP牙周組織中可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、MPO和H3cit NETs（圖2D, K, E, L）。TUNEL染色也顯示DP牙周組織中有大量凋亡細(xì)胞，而CP組未見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞（圖2F, M）。DP中F4/80巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量大于CP組（圖2N）。具體而言，DP組F4/80 CD86 M1巨噬細(xì)胞（圖2G, O）和F4/80 CD206 M2巨噬細(xì)胞（圖2H, P）數(shù)量明顯高于CP組。然而，在LIP模型的分辨率上，DP組的M2/M1巨噬細(xì)胞比例也明顯低于CP組（圖2Q）。總的來(lái)說(shuō)，凋亡中性粒細(xì)胞和NETosis在牙周組織中的積累加速了牙周炎的進(jìn)展，而凋亡中性粒細(xì)胞和NETs的延遲清除阻礙了小鼠DP炎癥的消退。

圖2 功能失調(diào)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞加重了小鼠DP的炎癥損傷并損害炎癥消退

3. SIRT6顯著調(diào)節(jié)高糖條件下巨噬細(xì)胞的胞葬作用
       鑒于上述結(jié)果，作者進(jìn)一步解讀HG是否抑制巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡中性粒細(xì)胞的胞葬作用，從而間接增加其殘基。HG刺激后巨噬細(xì)胞吞噬凋亡中性粒細(xì)胞的能力下降（圖3A）。鑒于DM中巨噬細(xì)胞簇的GO富集分析顯示NAD代謝異常（圖1D, E），作者進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)HG刺激可導(dǎo)致NAD/NADH代謝異常（圖3B）。Sirtuins（SIRTs）是NAD依賴性組蛋白去乙?；讣易澹谄咸烟欠€(wěn)態(tài)、炎癥、基因組穩(wěn)定性和DNA修復(fù)中發(fā)揮作用。因此，由于SIRT6在HG條件下明顯下調(diào)，在48 h和72 h時(shí)最為明顯，作者對(duì)其進(jìn)行了鑒定和重點(diǎn)研究（圖3C）。為了進(jìn)一步研究SIRT6在DP巨噬細(xì)胞中的可能功能，作者將巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68和SIRT6共染色，發(fā)現(xiàn)DP巨噬細(xì)胞中SIRT6的表達(dá)與CP相比顯著降低（圖3D）。SIRT6抑制劑顯著降低了巨噬細(xì)胞進(jìn)行胞葬的能力，而SIRT6過(guò)表達(dá)提高了巨噬細(xì)胞吞噬凋亡中性粒細(xì)胞的能力（圖3E, F）。綜上所述，高糖刺激導(dǎo)致巨噬細(xì)胞SIRT6的低表達(dá)，從而損害了胞葬作用。胞葬通過(guò)減少死細(xì)胞的DAMP釋放和維持生物穩(wěn)態(tài)來(lái)抑制炎癥。然而，當(dāng)糖尿病患者巨噬細(xì)胞的胞葬作用受損時(shí)，通過(guò)損傷相關(guān)分子識(shí)別模型，包括NETosis和壞死性凋亡在內(nèi)的促炎溶解細(xì)胞死亡，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，打破了M1和M2分化的平衡。

圖3 SIRT6顯著調(diào)節(jié)高糖條件下巨噬細(xì)胞的胞葬

4. 骨髓特異性SIRT6敲除會(huì)加重牙周炎并損害炎癥消退
       為了探索SIRT6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞胞葬在牙周炎中的作用，作者將LysM-Cre小鼠與SIRT6flox/flox小鼠雜交產(chǎn)生mS6KO小鼠。與同窩野生型小鼠骨髓巨噬細(xì)胞（BMMs）相比，mS6KO骨髓巨噬細(xì)胞吞噬凋亡中性粒細(xì)胞的能力下降（圖4A）。采用2月齡mS6KO小鼠及其WT窩代小鼠建立LIP模型和LIP分辨率模型。與WT小鼠相比，CEJ到ABC的距離（圖4B, I）和捕獲陽(yáng)性破骨細(xì)胞在mS6KO小鼠中顯著增加（圖4C, J）。為了研究巨噬細(xì)胞胞葬受損是否參與了mS6KO小鼠的持續(xù)性骨質(zhì)流失，通過(guò)TUNEL染色評(píng)估m(xù)S6KO小鼠和WT小鼠牙周組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)量（圖4D），結(jié)果顯示，與同窩野生型小鼠相比，mS6KO小鼠牙周組織中Ly6g細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著增加（圖4E, L）。SIRT6敲除促進(jìn)了mS6KO小鼠牙周組織中MPO H3cit的NETosis（圖4F, M）。此外，F(xiàn)4/80 CD86 M1巨噬細(xì)胞（圖4G, O）和F4/80 CD206 M2巨噬細(xì)胞（圖4H，P）在mS6KO小鼠牙周組織中顯著升高（圖4N），但抗炎F4/80 CD206 M2巨噬細(xì)胞在mS6KO小鼠牙周組織中的比例低于WT小鼠（圖4Q）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明SIRT6介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞胞葬與牙周破壞和炎癥消退有關(guān)。

圖4 髓細(xì)胞特異性SIRT6基因敲除會(huì)加重牙周炎并損害炎癥消退

5. SIRT6通過(guò)H3K56ac抑制miR-216a-5p-216b-5p-217簇的轉(zhuǎn)錄
       為了深入了解SIRT6調(diào)控巨噬細(xì)胞胞葬的詳細(xì)機(jī)制，作者進(jìn)一步評(píng)估了SIRT6對(duì)巨噬細(xì)胞中microRNA表達(dá)的影響。從SIRT6抑制后的巨噬細(xì)胞中分離RNA進(jìn)行miRNA PCR芯片分析，結(jié)果顯示miR-216a-5p-216b-5p-217簇明顯增加，SIRT6表達(dá)下調(diào)（圖5A, B, C）。最近的研究表明，miR-216/217在動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病等年齡相關(guān)疾病中起關(guān)鍵作用。與這些結(jié)果一致，作者的數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示SIRT6抑制和HG條件下miR-216a-5p-216b-5p-217簇表達(dá)增加（圖5D, F），SIRT6過(guò)表達(dá)下表達(dá)降低（圖5E）。為了進(jìn)一步闡明SIRT6如何抑制miR-216a-5p-216b-5p-217簇的表達(dá)，作者通過(guò)ChIP-qPCR檢測(cè)了巨噬細(xì)胞中SIRT6宿主基因MIR217HG啟動(dòng)子的組蛋白修飾。SIRT6通過(guò)催化位點(diǎn)3和9乙?；慕M蛋白H3賴氨酸殘基（H3K9ac和H3K56ac）32的去乙?；l(fā)揮轉(zhuǎn)錄共抑制作用。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)HG處理僅顯著上調(diào)H3K56ac的表達(dá)（圖5H）。使用覆蓋miR-216a-5p-216b-5p-217啟動(dòng)子的7對(duì)引物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示HG處理增加了miR-216a-5p-216b-5p-217集群?jiǎn)?dòng)子的H3K56ac水平（圖5I）。作者還進(jìn)一步證實(shí)了SIRT6抑制和HG條件下pri-miR-217簇表達(dá)增加（圖5J, L），SIRT6過(guò)表達(dá)后pri-miR-217簇表達(dá)下調(diào)（圖5K）。值得注意的是，來(lái)自mS6KO小鼠的BMMs表現(xiàn)出增加的pri-miR-217和miR-216a-5p-216b-5p-217簇表達(dá)（圖5G, M）。

圖5 SIRT6通過(guò)H3K56ac抑制miR-216a-5p-216b-5p-217簇的轉(zhuǎn)錄

6. SIRT6通過(guò)“非規(guī)范”微處理器復(fù)合物抑制miR-216a-5p-216b-5p-217簇成熟
       典型microRNA的成熟最初是初級(jí)microRNA（pri-miR）轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄，該轉(zhuǎn)錄物由核糖核酸酶III、Drosha（核糖核酸酶）和DGCR8組成的微處理器復(fù)合物鑒定和切割。有報(bào)道稱，葡萄糖代謝影響Drosha蛋白的表達(dá)，葡萄糖剝奪促進(jìn)Drosha表達(dá)，HG刺激抑制Drosha表達(dá)。同樣，作者的結(jié)果顯示HG刺激可以抑制巨噬細(xì)胞中Drosha蛋白的表達(dá)（圖6A）。盡管Drosha降低，但作者發(fā)現(xiàn)高葡萄糖導(dǎo)致miR216a-5p-216b-5p-217簇的高表達(dá)（圖5F）。為了進(jìn)一步探索HG條件下miR216a-5p-216b-5p-217簇成熟的機(jī)制，作者設(shè)計(jì)了一種特異性的生物素標(biāo)記的pri-miR-217探針，在巨噬細(xì)胞中進(jìn)行RNA沉淀實(shí)驗(yàn)，銀染色顯示與pri-miR-217結(jié)合的多條蛋白帶富集（圖6B）。同時(shí)，蛋白質(zhì)譜分析顯示hnRNPA2B1在識(shí)別蛋白列表中排名靠前，未觀察到Drosha和DGCR8。RIP實(shí)驗(yàn)顯示，與IgG相比，hnRNPA2B1抗體降低了更多的pri-miR-217（圖6C）。據(jù)報(bào)道，hnRNPA2B1與microRNA微處理器復(fù)合物蛋白DGCR8相互作用，通過(guò)結(jié)合m6A標(biāo)記初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄物來(lái)切割初級(jí)miRNA。內(nèi)源性hnRNPA2B1蛋白與巨噬細(xì)胞中DGCR8和Drosha的共免疫沉淀（Co-IP）表明它們之間存在直接的物理相互作用，hnRNPA2B1與DGCR8結(jié)合，而未觀察到Drosha（圖6F）。作者進(jìn)一步確定DGCR8可以與Drosha結(jié)合，這意味著hnRNPA2B1與DGCR8結(jié)合以招募Drosha形成微處理器復(fù)合物，“非規(guī)范”微處理器復(fù)合物識(shí)別并切割pri-miR-217（圖6E）。Co-IP還顯示SIRT6抑制促進(jìn)了“非規(guī)范”微處理器復(fù)合物的形成，SIRT6過(guò)表達(dá)減少了微處理器復(fù)合物（圖6G）。此外，作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，高糖增加了與pri-miR-217結(jié)合的hnRNPA2B1（圖6D）。Chip的結(jié)果也顯示HG處理增加了hnRNPA2B1啟動(dòng)子的H3K56ac（圖6H）。為了確定HG是否以hnRNPA2B1依賴性方式影響pri-miR-217的加工，作者對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行了hnRNPA2B1敲低，發(fā)現(xiàn)成熟miRNA的水平下降，而pri-miR-217的水平增加（圖6I, J）。FISH染色顯示HG刺激導(dǎo)致細(xì)胞核中pri-miR-217的減少，敲低hnRNPA2B1后細(xì)胞核中pri-miR-217的積累（圖6K）。這些數(shù)據(jù)表明SIRT6不僅可以促進(jìn)pri-miR-217的轉(zhuǎn)錄，還可以通過(guò)促進(jìn)HG條件下“非規(guī)范”微處理器復(fù)合物的形成來(lái)促進(jìn)miR216a-5p-216b-5p-217簇的成熟。

圖6 SIRT6通過(guò)“非規(guī)范”微處理器復(fù)合物抑制miR-216a-5p-216b-5p-217簇成熟

7. miR-216a-5p-216b-5p-217簇通過(guò)靶向DEL-1和CD36負(fù)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的胞葬作用
       DEL-1和CD36已被確定為巨噬細(xì)胞胞葬和清除炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。生物信息學(xué)算法（miRwalk）的結(jié)果表明，miR-216a-5p-216b-5p-217簇與DEL-1和CD36 mRNA的3'UTR結(jié)合（圖7A）。隨后，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miR216a-5p-216b-5p-217簇的共轉(zhuǎn)染降低了WT-DEL-1-3'UTR和WT-CD36-3'UTR的熒光素酶活性，而Mut-DEL-1-3'UTR和Mut-CD36 -3'UTR的熒光素酶活性不受影響（圖7B）。此外，蛋白質(zhì)印跡分析顯示，在miR216a-5p-216b-5p-217 mimic處理的巨噬細(xì)胞中，DEL-1和CD36的表達(dá)降低，而在miR-216b-5p-217 inhibitor處理的巨噬細(xì)胞中，DEL-1和CD36的表達(dá)升高（圖7C）。免疫熒光也證實(shí)了DEL-1和CD36在糖尿病牙周炎中的低表達(dá)（圖7D）。miR216a-5p-216b-5p-217簇的過(guò)表達(dá)降低了巨噬細(xì)胞的吞噬能力（圖7E）。在這三種microRNA中，miR-217對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響最大。在HG環(huán)境下敲低miR-217可以恢復(fù)巨噬細(xì)胞的胞葬，與重組DEL-1蛋白的作用類似（圖7F）?？傮w而言，作者的研究結(jié)果支持SIRT6通過(guò)促進(jìn)pri-miR-217轉(zhuǎn)錄和pri-miR“非規(guī)范”微處理器復(fù)合物的形成負(fù)調(diào)控miR216a-5p/216b-5p-217簇表達(dá)的假設(shè)。該microRNA簇通過(guò)靶向關(guān)鍵的胞葬分子DEL-1和CD36抑制巨噬細(xì)胞的胞葬，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥消退功能失調(diào)。

圖7 miR-216a-5p-216b-5p-217簇通過(guò)靶向DEL-1和CD36負(fù)性調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的胞葬

8. antagomir-217的局部給藥促進(jìn)小鼠DP炎癥的消退
       根據(jù)上述功能獲得和功能喪失研究中的吞噬指數(shù)觀察，miR-217表現(xiàn)出更好的表型，并被選擇用于體內(nèi)干預(yù)治療。作者在結(jié)扎絲后第3、6、9和12天立即將miR-217特異性拮抗劑或scramble（NC）-miR注射到糖尿病小鼠的牙周組織中（圖8A）。在第7天解除結(jié)扎后，antagomir-217注射明顯改善了糖尿病小鼠牙周炎癥和骨質(zhì)丟失（圖8B, C, G, H）。注射antagomir-217后，糖尿病小鼠牙周組織中DEL-1的表達(dá)明顯增加（圖8D, I）。注射antagomir-217后，糖尿病小鼠牙周組織中Ly6g中性粒細(xì)胞的數(shù)量明顯減少（圖8E, J）。注射antagomir-217后，MPO H3cit NET（圖8L）和凋亡細(xì)胞的形成明顯減少（圖8F, K）。antagomir-217治療組M2型抗炎巨噬細(xì)胞（圖8O）比例較高，而對(duì)照組大部分巨噬細(xì)胞為M1型巨噬細(xì)胞（圖8M, N, P）。總而言之，這些結(jié)果表明，通過(guò)沉默miR-217抑制SIRT6 / miR216a-5p-216b-5p-217簇/ DEL-1和CD36調(diào)節(jié)軸可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的胞葬以清除凋亡細(xì)胞，這意味著該調(diào)節(jié)軸具有作為糖尿病炎癥解決靶點(diǎn)的潛力。

圖8 antagomir-217的局部給藥促進(jìn)小鼠DP炎癥的消退

結(jié)論：
       綜上所述，作者揭示了SIRT6-miR-216/217軸在糖尿病背景下巨噬細(xì)胞胞葬中的重要作用，并概述了通過(guò)抑制miR-217來(lái)改善炎癥消退和牙周組織修復(fù)的方法。這一策略可能與糖尿病和其他慢性炎癥性疾病的管理相關(guān)。
參考文獻(xiàn)：
Li B, Xin Z, Gao S, et al. SIRT6-regulated macrophage efferocytosis epigenetically controls inflammation resolution of diabetic periodontitis. Theranostics. 2023 Jan 1;13(1):231-249.