巨噬細胞轉錄因子TonEBP通過損傷誘導的信號通路促進系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腎損傷

       系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種自身免疫性疾病，其特征是自身反應性B細胞和包括髓系細胞在內的許多其他類型免疫細胞的失調。狼瘡性腎炎（LN）是SLE常見的靶器官表現。強直反應增強結合蛋白（TonEBP又稱T淋巴細胞核因子5（NFAT5）），最初被鑒定為細胞對高滲應激反應的中心調節(jié)因子，是一種多效應激蛋白，參與多種免疫代謝疾病。為探討TonEBP的作用，研究檢測了LN患者腎活檢樣本。與對照組相比，TonEBP在患者腎臟細胞和浸潤的免疫細胞中表達升高。腎臟TonEBP mRNA在LN中升高，并與編碼炎癥細胞因子的mRNA和蛋白尿程度相關。在降植烷誘導的小鼠SLE模型中，髓系TonEBP缺陷阻斷了SLE和LN的發(fā)展。在巨噬細胞中，響應損傷相關分子模式的各種Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）通過刺激其啟動子誘導TonEBP表達。TLRs下游的細胞內信號依賴于TonEBP。因此，TonEBP可以作為NF-kB的轉錄輔助因子，通過蛋白-蛋白相互作用激活mTOR-IRF3/7。此外，TonEBP缺陷的巨噬細胞表現出更高的胞葬作用，TonEBP髓系缺陷的動物表現出Th1和Th17分化減少，與TLR信號缺陷的巨噬細胞一致。因此，本研究數據表明髓系TonEBP可能是SLE和LN有吸引力的治療靶點。研究于2023年4月發(fā)表于期刊《Kidney International》上，IF：18.998。

技術路線：

主要研究結果：
1、LN患者的臨床特征
       作者首先根據臨床數據判斷SLE和LN患者的特征。盡管所有患者均出現血尿，但LN組的蛋白尿水平高于對照組，血清補體水平低于對照組（表1）。表2展示了LN患者的臨床特征。

2、LN患者腎臟中促炎細胞因子的表達上調，并與TonEBP mRNA表達相關
       由于TonEBP的表達上調驅動促炎細胞因子的轉錄，是類風濕關節(jié)炎和肝炎中炎癥組織的關鍵特征，作者首先分析冷凍腎活檢樣本中TonEBP編碼的mRNA表達和細胞因子。LN組TonEBP mRNA表達高于對照組（圖1a）。LN組中IL6、IL1B、MCP1、TNFA和IFNB mRNA的表達也顯著升高。此外，MCP1、IFNA和IFNB mRNA的表達與TonEBP mRNA的表達具有相關性（圖1b），這與TonEBP在促炎細胞因子轉錄中的作用一致。

圖1 LN患者腎中TonEBP和促炎因子mRNA的表達

3、LN患者腎TonEBP升高
       接下來，作者進行了腎臟TonEBP的免疫組化檢測。TonEBP在細胞核和細胞質中均有明顯表達（圖2a）。在LN患者腎小球中，TonEBP定位于多種細胞類型，包括足細胞、壁上皮細胞、內皮細胞和中性粒細胞。LN組腎間質區(qū)域大量免疫細胞浸潤。在腎小管中，TonEBP在尿調蛋白染色陽性的遠端小管和尿調蛋白染色陰性的集合管中表達明顯，而在近端小管中表達較弱（圖2a）。LN組腎各部位（腎小球、間質和腎小管區(qū)）TonEBP陽性細胞的數量明顯高于對照組（圖2b）。因此，TonEBP的腎蛋白表達在LN中明顯升高，與其mRNA水平一致。
       接下來，作者利用多重免疫熒光染色將TonEBP表達定位到各種腎臟和免疫細胞。LN組中TonEBP陽性細胞數明顯升高（圖3）。在上皮和內皮（CD31⁺）細胞中觀察到增加。免疫細胞（圖3）：CD4⁺ T細胞、CD8⁺ T細胞、CD68⁺巨噬細胞、TonEBP⁺ CD86⁺ M1巨噬細胞也是如此。然而，作者無法充分評估腎臟TonEBP⁺ CD206⁺ B細胞、TonEBP⁺ CD11⁺樹突狀細胞和TonEBP⁺ CD206⁺ M2巨噬細胞，因為這些細胞數量太少。綜上所述，在LN中，TonEBP在腎臟細胞和浸潤的免疫細胞中表達升高，包括CD4⁺ T細胞和巨噬細胞。

圖2 LN患者TonEBP的腎臟分布

圖3 多重免疫熒光染色腎活檢組織內皮細胞、上皮細胞和浸潤性免疫細胞中TonEBP的表達

4、TonEBP單倍體缺陷預防前列腺素誘導的狼瘡
       接下來，作者詢問是什么觸發(fā)了TonEBP的腎臟表達。為響應這個問題，作者使用了單次注射降植烷誘導的SLE小鼠模型（圖4a）。作者隨后比較TonEBP單倍型缺陷（TonEBP^+/D）小鼠和野生型（TonEBP^+/+）小鼠，因為單倍型缺陷動物對實驗性誘導的類風濕性關節(jié)炎和糖尿病腎病具有抵抗力。野生型小鼠表現出明顯的SLE/LN表型，包括脾腫大、循環(huán)抗dsDNA自身抗體水平升高、血清補體成分3水平降低、腎臟肥大和腎小球損傷，并伴有腎小球IgG和補體成分3沉積（圖4b-h）。此外，與LN患者相似，腎組織中TonEBP的表達明顯升高。更重要的是，這種表型在TonEBP單倍體缺陷動物中缺失，表明TonEBP可能參與SLE的發(fā)生和相關腎損傷。

圖4 TonEBP單倍體缺陷預防SLE和腎損傷的發(fā)展

5、髓系TonEBP是前列腺素誘導狼瘡發(fā)展所必需的
       髓樣TonEBP是類風濕關節(jié)炎中樹突狀細胞成熟和巨噬細胞活化所必需的。鑒于作者在LN患者巨噬細胞中觀察到TonEBP升高（圖3），作者利用髓系特異性敲除小鼠TonEBP（TonEBP^fl/fl , LysM-cre）及其同窩的TonEBP^fl/fl探索髓系TonEBP的作用（圖5a）。作者發(fā)現TonEBP髓系特異性缺失的小鼠與TonEBP單倍型缺失的小鼠相似，均未發(fā)生SLE和LN（圖5b-h）。在髓系TonEBP缺陷小鼠中，腎臟TonEBP表達增加也被減弱（圖5h）。

圖5 髓系TonEBP缺乏可減輕SLE和腎損傷的嚴重程度

6、髓系TonEBP是前列腺素誘導狼瘡中髓系細胞擴張和激活所必需的
       接下來，作者詢問髓系細胞TonEBP缺失是否影響脾臟中免疫細胞群。雖然TonEBP^fl/fl動物的巨噬細胞（CD11b⁺ F4^/80⁺細胞）或中性粒細胞（CD11⁺-6G⁺細胞）數量顯著增加，但在TonEBP^fl/fl, Lys M-cre同窩動物中沒有觀察到增加（圖6a-b）。
       MHCⅡ和共刺激分子（CD80和CD86）的表面表達對于抗原呈遞細胞誘導的抗原呈遞和T細胞分化非常重要。降植烷處理后，TonEBP^fl/fl小鼠脾臟CD11b ⁺細胞群表面CD86和MHCII表達升高，而TonEBP^fl/fl，LysM-cre小鼠脾臟CD11b ⁺細胞群表面CD86和MHCII表達降低（圖6c）。

圖6 髓系TonEBP缺乏可阻斷巨噬細胞和嗜中性粒細胞的擴張，以及T -輔助細胞1（Th1）和T -輔助細胞17（Th17）細胞的分化

7、髓系TonEBP是前列腺素誘導狼瘡中Th1和Th17細胞反應所必需的
       抗原遞呈細胞將抗原遞呈給T細胞，激活并觸發(fā)初始T細胞的分化，是SLE發(fā)病機制中的關鍵事件。由于髓系TonEBP對于抗原呈遞細胞的擴增和抗原呈遞相關分子的表達是必需的，因此作者詢問髓系TonEBP是否有助于T細胞分化。首先，作者分析了降植烷處理后4個月的全脾淋巴細胞亞群。盡管TonEBP缺失降低了CD19⁺ B220⁺細胞的比例，但CD4⁺和CD8⁺ T細胞群的比例并未受到影響。作者進一步分析CD4⁺ T細胞發(fā)現，髓系特異性TonEBP缺陷小鼠中輔助性Th1和Th17細胞和調節(jié)性T細胞數量無變化（圖6d）。

8、TonEBP通過NF-kB和mTOR-IRF3/7磷酸化介導TLR介導的巨噬細胞活化
       為了解TonEBP在髓系細胞中的作用，作者決定研究巨噬細胞。作者使用從雌性TonEBP^fl/fl、Lys Mcre小鼠及其同窩TonEBP^fl/fl小鼠分離的腹腔巨噬細胞（PMs）。作者發(fā)現，這些配體以TonEBP依賴的方式誘導與Th1^/Th17分化相關的促炎細胞因子和I型IFNs的表達（圖7a）。TonEBP依賴的CD80、CD86和MHCⅡ基因和蛋白的誘導模式相同（圖7b，圖8）。這些變化與TonEBP表達升高有關（圖7a）。
       此外，作者試圖揭示TonEBP發(fā)揮作用的分子機制。首先，作者想知道TonEBP的誘導是否與TonEBP啟動子的激活有關。為解決這個問題，作者構建了一個包含z5-kb人TonEBP啟動子序列的pGL3熒光素酶報告載體。LPS、R848和CpG-B刺激RAW264.7細胞中TonEBP啟動子驅動的熒光素酶表達> 5倍（圖9a）。這些數據表明TLRs的參與通過啟動子驅動TonEBP的表達。
       接下來，作者檢測了來自TonEBP^D /D小鼠的胚胎成纖維細胞，其中TonEBPD等位基因的基因產物不能刺激NF-kB，因為它不與p65相互作用。在這些細胞中，NF-kB響應TLR配體的激活被阻斷（圖9b），TonEBP-p65相互作用缺失（圖9c）。總之，這些數據表明TonEBP通過與p65的蛋白質相互作用來刺激NF-kB響應TLR配體。
       作者還檢測了TLR配體刺激RAW264.7細胞中IRF3和IRF7的表達，IRF3和IRF7調控的I型IFN-Ifnb1的mRNA表達被TLR配體以TonEBP依賴的方式刺激。IRF3的磷酸化可被LPS和R848刺激，而IRF7的磷酸化可被R848和CpG-B刺激，并呈TonEBP依賴性（圖9d-e）。

圖7 TonEBP調節(jié)巨噬細胞中TLRs介導的免疫反應和抗原遞呈相關基因

圖8 TonEBP促進巨噬細胞參與TLRs介導的激活和抗原遞呈的分子表達

圖9 TonEBP介導NF-kB轉錄活性和IRF3/7響應TLRs配體的磷酸化。

9、TonEBP阻斷巨噬細胞的胞葬
       鑒于凋亡細胞清除在SLE發(fā)病機制中的重要性，作者檢測了TonEBP在PMs胞葬作用中的作用。首先，作者評估了負責胞葬作用的橋接分子（Gas6和CD36）和調節(jié)吞噬作用受體（Nr1h3和Ppard）的轉錄因子的表達。TonEBP缺失的PMs在TLR配體的反應中顯示出與這些轉錄因子和橋接分子相關的基因的高表達（圖10a）。接下來，作者檢測了PMs對凋亡細胞的吞噬能力，發(fā)現TonEBP缺失的PMs表現出更高的吞噬活性（圖10b-c）。這些數據表明，巨噬細胞中的TonEBP阻止凋亡細胞的吞噬，與吞噬活性相關基因的表達降低有關。
       總之，從小鼠中獲得的數據表明，巨噬細胞中的TonEBP通過激活NF-kB和IRF3^/7磷酸化，抑制胞葬作用，刺激自身免疫反應、抗原呈遞和Th1^/Th17細胞發(fā)育，從而參與SLE^/LN的發(fā)?。▓D10d）。

圖10 髓系TonEBP缺乏阻斷TLRs介導的凋亡細胞清除惡化

實驗方法
       qRT-PCR，雜合TonEBP小鼠（TonEBP^+/; Nfat5^+/tm1Snh），小鼠SLE模型
參考文獻
Yoo EJ, Oh KH, Piao H, Kang HJ, Jeong GW, Park H, Lee CJ, Ryu H, Yang SH, Kim MG, Kim DK, Park SH, Lim BJ, Lee SM, Park CY, Choi SY, Lee-Kwon W, Yang J, Kwon HM. Macrophage transcription factor TonEBP promotes systemic lupus erythematosus and kidney injury via damage-induced signaling pathways. Kidney Int. 2023 Apr 22:S0085-2538(23)00261-2. doi: 10.1016/j.kint.2023.03.030