P. gingivalis感染上調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞PD-L1表達(dá)，抑制CD8+?T細(xì)胞反應(yīng)，加重口腔癌

欄目：最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間：2023-09-19
研究表明靶向Pg和/或其介導(dǎo)的信號(hào)通路可能是一種提高檢查點(diǎn)阻斷免疫療法療效的治療策略......

       越來(lái)越多的證據(jù)表明，樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)上PD-L1的表達(dá)對(duì)癌癥免疫治療至關(guān)重要，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis, Pg)的定植加劇了上胃腸道癌癥的進(jìn)展。然而，在口腔癌感染環(huán)境中，Pg感染對(duì)DC中PD-L1表達(dá)的影響以及相關(guān)的免疫后果仍未研究。在培養(yǎng)細(xì)胞和全身感染實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)Pg感染以牙齦素依賴的方式增強(qiáng)了DC上PD-L1的表達(dá)。Pg感染通過(guò)上調(diào)卵清蛋白(OVA)脈沖DC上的PD-L1表達(dá)來(lái)抑制抗原特異性CD8+ T細(xì)胞。這種抑制表現(xiàn)為IFNγ、穿孔素、顆粒酶B和CD107a的減少。進(jìn)一步分析表明，Pg顯著降低了CD8+ T細(xì)胞裂解OVA脈沖靶細(xì)胞的能力。此外，Pg感染增加了Akt和STAT3的磷酸化，導(dǎo)致PD-L1表達(dá)顯著增加。通過(guò)使用siRNA、過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和藥物抑制劑證實(shí)了這一點(diǎn)。與體外觀察結(jié)果一致，在同基因小鼠口腔癌模型中，Pg感染顯著增強(qiáng)了瘤內(nèi)組織和頸部淋巴結(jié)DC上PD-L1的表達(dá)，并加速了口腔癌的進(jìn)展，而Pg賴氨酸特異性、牙齦缺陷突變體則沒(méi)有這樣做。當(dāng)用抗生素或STAT3抑制劑預(yù)處理腫瘤細(xì)胞時(shí)，Pg的這些影響在很大程度上減弱。因此，我們證明Pg感染通過(guò)Akt-STAT3信號(hào)通路上調(diào)DC上PD-L1的表達(dá)，抑制CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并加劇口腔癌的生長(zhǎng)，這表明靶向Pg和/或其介導(dǎo)的信號(hào)通路可能是一種提高檢查點(diǎn)阻斷免疫療法療效的治療策略。本文于2023年3月發(fā)表于Cancer Immunology Research (IF=12.02)。

技術(shù)路線：


結(jié)果：
(1) P. gingivalis感染以牙齦素依賴的方式上調(diào)DCs上PD-L1的表達(dá)
       據(jù)報(bào)道，PD-L1在DCs表面組成性表達(dá)以抑制效應(yīng)T細(xì)胞的激活。使用培養(yǎng)10天的GMDCs和Flt3l-DCs，我們首先檢查牙齦卟啉單胞菌感染是否影響DCs的頻率和成熟。與未受刺激的對(duì)照組相比，牙齦卟啉單胞菌感染提高了CD80/CD86的表達(dá)，但沒(méi)有顯著改變兩種DCs上CD11b和CD11c的表達(dá)(補(bǔ)充圖S1)，這表明牙齦卟啉單胞菌感染可能影響DC的成熟，但對(duì)DCs的數(shù)量影響不大。接下來(lái)，我們檢測(cè)了PD-L1在GMDCs上對(duì)牙齦卟啉單胞菌感染的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，與未受刺激或共生菌S. sanguinis刺激的細(xì)胞相比，牙齦卟啉單胞菌感染顯著增加了GMDCs上PD-L1的表達(dá)(圖1A-C)，Western blot進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)(圖1D)。我們未觀察到DCs上PD-L2的表達(dá)有任何顯著變化(圖1E)。因?yàn)镚M-CSF刺激優(yōu)先擴(kuò)展2型常規(guī)DC (cDC2)亞群，而Flt3l刺激擴(kuò)展1型DC (cDC1)，我們接下來(lái)研究了牙齦卟啉單胞菌感染是否促進(jìn)了Flt3l-DCs上PD-L1的表達(dá)。P. gingivalis侵襲后，F(xiàn)lt3l-DCs上PD-L1的表達(dá)顯著增加(圖1F-J)。
       考慮到與CD8+ T細(xì)胞相比，F(xiàn)lt3l介導(dǎo)的cDC1細(xì)胞在腫瘤抗原交叉呈遞方面更有效，我們?cè)谡麄€(gè)研究中都使用了Flt3l-DCs。為了研究牙齦卟啉單胞菌的毒力因子對(duì)PD-L1表達(dá)的調(diào)控，我們接下來(lái)研究了感染△Kgp突變體是否會(huì)影響Flt3-DCs上PD-L1的表達(dá)。缺乏gingippain使P. gingivalis上調(diào)PD-L1表達(dá)的能力喪失(圖1F-J)，Western blot進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)(圖1J)。由于干擾素是DCs上PD-L1表達(dá)的主要因素，我們還利用中和抗體阻斷I型IFN受體2和II型干擾素，以檢驗(yàn)牙齦卟啉單胞菌是否通過(guò)干擾素的重新合成促進(jìn)PD-L1表達(dá)。在使用中和抗體和同型對(duì)照治療的樹(shù)突狀細(xì)胞中，PD-L1未發(fā)生實(shí)質(zhì)性變化(圖1K)，表明干擾素可能不參與牙齦卟啉單胞菌增強(qiáng)PD-L1表達(dá)。綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，牙齦卟啉單胞菌感染促進(jìn)了DCs上PD-L1的表達(dá)，而牙齦蛋白酶是這一過(guò)程的關(guān)鍵因素。
       接下來(lái)，我們檢測(cè)了PD-L1在脾DCs中的表達(dá)(MHC-II+ CD11c+；圖2A,B)，小鼠接種牙齦卟啉單胞菌或其突變體△Kgp 24小時(shí)。同樣地，S. sanguinis被用作共生控制菌。與感染共生菌相比，P. gingivalis顯著增強(qiáng)了CD11c+MHC-II+細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)，而△Kgp在很大程度上失去了這種能力(圖2C-E)。此外，我們使用了體內(nèi)牙齦卟啉單胞菌慢性感染模型，正如我們?cè)谥暗难芯恐兴龅哪菢?，?lái)檢查感染小鼠中DC表型的可能改變。我們發(fā)現(xiàn)口腔牙齦卟啉單胞菌感染導(dǎo)致CLNs DCs上PD-L1表達(dá)顯著增加，而△Kgp突變體和共體對(duì)照則沒(méi)有這樣做(圖2F-H)?？傊?，這些結(jié)果首次證明，牙齦卟啉單胞菌在體外和體內(nèi)促進(jìn)DCs上PD-L1的表達(dá)，其方式依賴于賴氨酸特異性牙齦蛋白酶的存在。


圖1：牙齦卟啉單胞菌感染增強(qiáng)PD-L1在GMDCs和Flt3l-DCs上的表達(dá)，并以牙齦素依賴的方式增強(qiáng)

圖2：體內(nèi)牙齦卟啉單胞菌感染可促進(jìn)DCs上PD-L1的表達(dá)

(2) P. gingivalis感染通過(guò)Akt和STAT3信號(hào)通路增強(qiáng)DC-PD-L1的表達(dá)
       牙齦卟啉單胞菌感染激活了大量的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥免疫反應(yīng)。鑒于Akt和STAT3都是PD-L1表達(dá)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，我們接下來(lái)研究了牙齦卟啉單胞菌感染介導(dǎo)的DC-PD-L1上調(diào)是否通過(guò)Akt和STAT3進(jìn)行。正如所料，P. gingivalis感染強(qiáng)勁增加一種蛋白激酶的磷酸化和STAT3(圖3A,B),但△Kgp變異僅略增強(qiáng)磷酸化STAT3和未能產(chǎn)生一種蛋白激酶磷酸化(圖3C)。考慮到Akt和STAT3磷酸化的趨勢(shì)(圖3A-C)與PD-L1表達(dá)的趨勢(shì)(圖1G-J)相似，P. gingivalis和△Kgp的挑戰(zhàn)下，PD-L1的升高可能是通過(guò)Akt和STAT3的調(diào)節(jié)。為了進(jìn)一步證明這一點(diǎn)，我們使用特異性Akt抑制劑MK2206治療DCs，并檢測(cè)PD-L1在牙齦卟啉單胞菌侵襲下的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，抑制Akt可使牙齦卟啉單胞菌刺激的DC中PD-L1的表達(dá)呈劑量依賴性降低(圖3D-F)，并通過(guò)Western blot證實(shí)了這一點(diǎn)(圖3G)。此外，Akt抑制可導(dǎo)致磷酸化和總STAT3減少(圖3G)，這表明STAT3可能是Akt的下游靶點(diǎn)(圖3G)。通過(guò)觀察，STAT3抑制未能影響牙齦卟啉單胞菌刺激的DC中Akt的磷酸化，這一點(diǎn)得到了相反的證實(shí)(圖3H)。此外，我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)siRNA對(duì)STAT3進(jìn)行化學(xué)抑制或基因沉默，可導(dǎo)致牙齦卟啉單胞菌刺激的DC中PD-L1表達(dá)顯著降低(圖3I,J)。為了排除siRNA可能的脫靶效應(yīng)，并驗(yàn)證STAT3對(duì)PD-L1表達(dá)的影響，我們將編碼STAT3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到DC中，發(fā)現(xiàn)STAT3過(guò)表達(dá)(圖3K)會(huì)導(dǎo)致PD-L1在牙齦卟啉單胞菌攻擊后顯著升高(圖3K,L)。這些數(shù)據(jù)表明，P. gingivalis誘導(dǎo)DC上PD-L1表達(dá)升高是通過(guò)調(diào)節(jié)Akt-STAT3信號(hào)傳導(dǎo)。


圖3：P. gingivalis感染激活A(yù)kt-STAT3信號(hào)通路，從而促進(jìn)DCs上PD-L1的表達(dá)

(3) P. gingivalis介導(dǎo)的Akt-STAT3信號(hào)通路促進(jìn)PD-L1表達(dá)并抑制CD8+ T細(xì)胞活性
       接下來(lái)，我們研究了牙齦卟啉單胞菌對(duì)CD8+ T細(xì)胞活化的可能影響。為此，用抗原OVA肽(SIINFEKL)預(yù)脈沖Flt3l-DCs，濃度為0.1至10 ng/mL，然后用牙齦卟啉單胞菌攻毒，并與來(lái)自O(shè)T-I小鼠的OVA特異性脾CD8+ T細(xì)胞共培養(yǎng)3天。因?yàn)橛^察到1 ng/mL的OVA刺激產(chǎn)生最高水平的IL2 (補(bǔ)充圖S2)，我們?cè)诮酉聛?lái)的實(shí)驗(yàn)中使用這個(gè)濃度。P. gingivalis處理顯著提高了DC上PD-L1的表達(dá)，這與我們?cè)趫D1中的觀察結(jié)果一致，表明P. gingivalis感染在不同情況下促進(jìn)PD-L1的表達(dá)(圖4A)。此外，OVA脈沖DC有效地激活了CD8+ T細(xì)胞，其表現(xiàn)為顯著增加的效應(yīng)分子，包括Prf、GrB和CD107a，以及標(biāo)志細(xì)胞因子IFNγ和IL2 (圖4B-G)。然而，當(dāng)抗原脈沖DC受到牙齦卟啉單胞菌攻擊時(shí)，效應(yīng)分子和標(biāo)記細(xì)胞因子的產(chǎn)生顯著減少(圖4B-G)，ELISA進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)(圖4D,E)。這些結(jié)果表明，牙齦卟啉單胞菌感染增強(qiáng)了PD-L1的表達(dá)，抑制了CD8+ T細(xì)胞活性。
       為了進(jìn)一步確定P. gingivalis是否通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3和PD-L1介導(dǎo)CD8+ T細(xì)胞的抑制，我們首先使用STAT3抑制劑WP-1066治療抗原脈沖DC，然后用P. gingivalis攻擊并與CD8+ T細(xì)胞共培養(yǎng)。72小時(shí)后，我們發(fā)現(xiàn)WP-1066顯著降低了PD-L1的表達(dá)，同時(shí)提高了CD8+ T細(xì)胞中IFNγ、Prf、CD107a和GrB的表達(dá)(圖5A-E)。此外，我們還利用PD-L1拮抗劑結(jié)合肽(D)-PPA阻斷PD-L1/PD-1的結(jié)合，以確定PD-L1在牙齦卟啉單胞菌抑制CD8+ T細(xì)胞活性中的作用。正如預(yù)期的那樣，用(D)-PPA肽阻斷PD-L1對(duì)DC的抑制作用顯著減弱了牙齦卟啉單胞菌感染對(duì)Prf、IL2和GrB產(chǎn)生的抑制作用(圖5F-H)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明牙齦卟啉單胞菌感染通過(guò)STAT3介導(dǎo)的DC細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)抑制CD8+ T細(xì)胞活性。


圖4：牙齦卟啉單胞菌感染可促進(jìn)DC-PD-L1并抑制CD8+ T細(xì)胞活性

圖5：牙齦卟啉單胞菌感染通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3活性抑制CD8+ T細(xì)胞活性

(4) 感染P. gingivalis可抑制CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒性
       為了進(jìn)一步評(píng)估牙齦卟啉單胞菌感染對(duì)CD8+ T細(xì)胞毒性的影響，我們接下來(lái)將CD8+ T細(xì)胞與靶細(xì)胞(EL4細(xì)胞系)共培養(yǎng)，靶細(xì)胞用兩種不同濃度的CFSE (1和0.1 mmol/L)。通過(guò)控制CFSE+CD8?細(xì)胞，我們?cè)谶M(jìn)一步分析中排除了可能的死細(xì)胞干擾(圖6A)。P. gingivalis在所有組(三種不同的效應(yīng)/靶比)中顯著降低了CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，以裂解靶細(xì)胞的數(shù)量表示(圖6B,C)。經(jīng)牙齦卟啉單胞菌預(yù)處理的DC細(xì)胞組的靶細(xì)胞裂解率顯著低于未處理的DC細(xì)胞組(圖6C)。此外，STAT3抑制顯著提高了CD8+ T細(xì)胞在牙齦卟啉單胞菌侵染下的細(xì)胞毒性(圖6D)。值得注意的是，與野生型親本菌株相比，感染△Kgp突變體顯著增加了裂解的靶細(xì)胞(圖6E)?？傊@些結(jié)果表明，牙齦卟啉單胞菌感染通過(guò)調(diào)節(jié)DC中STAT3激活和PD-L1表達(dá)來(lái)?yè)p害CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，這種能力至少部分地依賴于賴氨酸特異性牙齦蛋白酶的存在。


圖6：牙齦卟啉單胞菌感染抑制CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒性

(5) 在同基因口腔癌模型中，P. gingivalis感染促進(jìn)DCs上PD-L1的表達(dá)，并加劇口腔癌的進(jìn)展
       為了評(píng)估牙齦卟啉單胞菌感染對(duì)口腔癌中DC-PD-L1表達(dá)和CD8+ T細(xì)胞活性的影響，我們接下來(lái)使用了一種同源小鼠模型，其中將經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)牙齦卟啉單胞菌預(yù)處理的MOC1細(xì)胞接種到小鼠舌頭中(圖7A)。我們發(fā)現(xiàn)，來(lái)自牙齦卟啉單胞菌感染小鼠淋巴結(jié)的CD11c+MHC-II+ DCs比來(lái)自對(duì)照小鼠的DC的PD-L1表達(dá)明顯更高(圖7B；P<0.001)。然而，用STAT3抑制劑治療或喂食抗生素水可顯著降低PD-L1的表達(dá)(圖7B)。此外，牙齦卟啉單胞菌感染導(dǎo)致CD8+ T細(xì)胞上PD-1表達(dá)顯著增加(補(bǔ)充圖S2)，這表明PD-L1和PD-1都可能是牙齦卟啉單胞菌調(diào)節(jié)CD8+ T細(xì)胞活性的靶點(diǎn)。PD-L1在DC上的過(guò)度表達(dá)已被證明會(huì)降低免疫治療的療效并加劇癌癥進(jìn)展。因此，我們研究了牙齦卟啉單胞菌感染是否會(huì)加劇口腔癌的進(jìn)展。與未處理的MOC1細(xì)胞相比，經(jīng)牙齦卟啉單胞菌預(yù)處理的MOC1細(xì)胞發(fā)育成更大的腫瘤，根據(jù)先前研究中描述的舌組織腫瘤腫塊面積估計(jì)(圖7C)。然而，與僅感染牙齦卟啉單胞菌或假對(duì)照組相比，感染牙齦卟啉單胞菌的小鼠在接受抗生素或WP-1066治療后，腫瘤質(zhì)量顯著下降(圖7C)。這些結(jié)果與先前大量研究一致，表明牙齦卟啉單胞菌感染促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，惡化癌癥患者的預(yù)后?？紤]到目前還沒(méi)有一種被廣泛接受的測(cè)量方法來(lái)估計(jì)MOC1介導(dǎo)的同基因模型中的腫瘤體積，我們使用臨床RECIST 1.1指南，并使用腫瘤腫塊的最長(zhǎng)尺寸來(lái)估計(jì)腫瘤體積。正如預(yù)期的那樣，通過(guò)測(cè)量H&E染色圖像中腫瘤腫塊的最大直徑(圖7D,E)，我們觀察到各組腫瘤體積變化的趨勢(shì)與測(cè)量腫瘤腫塊面積(圖7D,E)相似。此外，我們還使用免疫熒光檢測(cè)浸潤(rùn)腫瘤組織的DC中PD-L1的表達(dá)。P. gingivalis感染顯著促進(jìn)腫瘤內(nèi)DC上PD-L1的表達(dá)，但抗生素或STAT3抑制顯著降低PD-L1的表達(dá)(圖7F,G, P<0.001)，這與淋巴結(jié)DC上PD-L1表達(dá)的改變是一致的。
       為了研究在口腔自然感染環(huán)境下牙齦卟啉單胞菌感染與腫瘤進(jìn)展的臨床相關(guān)性，我們首先用口腔感染了牙齦卟啉單胞菌，然后將未感染的MOC1細(xì)胞接種到小鼠的舌頭中。如上所述，我們檢測(cè)了PD-L1在來(lái)自CLNs和腫瘤組織的DC上的表達(dá)以及腫瘤的生長(zhǎng)情況。我們發(fā)現(xiàn)，口腔預(yù)感染牙齦卟啉單胞菌的小鼠的DC-PD-L1表達(dá)顯著高于未感染的對(duì)照組，盡管略低于接種預(yù)感染的MOC1細(xì)胞并隨后口腔感染牙齦卟啉單胞菌的小鼠(圖7H-J, P<0.001)。此外，腫瘤體積改變的趨勢(shì)與DC-PD-L1表達(dá)的趨勢(shì)相似(圖7K-M, P<0.001)，表明牙齦卟啉單胞菌感染可能通過(guò)改變腫瘤微環(huán)境中的免疫景觀參與腫瘤進(jìn)展。此外，在MOC1細(xì)胞中感染牙齦卟啉單胞菌△Kgp突變體未能顯著促進(jìn)PD-L1表達(dá)和腫瘤進(jìn)展(圖7H-M, P<0.001)?？傊?，這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了我們的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并表明在同基因小鼠模型中，牙齦卟啉單胞菌感染增強(qiáng)了PD-L1的表達(dá)并加劇了口腔癌的進(jìn)展。


圖7：在同基因口腔癌模型中，牙齦卟啉單胞菌感染促進(jìn)DCs上PD-L1的表達(dá)，并加劇口腔癌的進(jìn)展

結(jié)論
       我們首次證明了牙齦卟啉單胞菌感染可提高DCs表面PD-L1的表達(dá)，抑制CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并加劇口腔癌的進(jìn)展。此外，我們發(fā)現(xiàn)牙齦疼痛和P. gingivalis介導(dǎo)的Akt-STAT3信號(hào)的激活對(duì)于DC-PD-L1的上調(diào)和隨后CD8+ T細(xì)胞毒性的抑制至關(guān)重要。鑒于針對(duì)PD-1及其配體的抗體在癌癥免疫治療中的成功應(yīng)用，我們的研究結(jié)果為進(jìn)一步了解牙齦卟啉單胞菌的免疫抑制特性提供了更多的見(jiàn)解，并確定了操縱免疫反應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，從而提高癌癥免疫治療的療效。

實(shí)驗(yàn)方法
小鼠、細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)，ELISA，Western blots，Stat3 siRNA和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，淋巴細(xì)胞分離，DCs和OT-I T細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞染色及流式細(xì)胞術(shù)，交叉呈遞試驗(yàn)和CD8+ T細(xì)胞毒性試驗(yàn)，全身細(xì)菌感染試驗(yàn)，MOC1細(xì)胞接種誘導(dǎo)同源口腔癌模型及免疫組化
參考文獻(xiàn)
Ren, J., Han, X., Lohner, H., Hoyle, R. G., Li, J., Liang, S., & Wang, H. (2023). P. gingivalis Infection Upregulates PD-L1 Expression on Dendritic Cells, Suppresses CD8+ T-cell Responses, and Aggravates Oral Cancer. Cancer immunology research, 11(3), 290–305. https://doi.org/10.1158/2326-6066.CIR-22-0541.